液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

こんにちは、Jay Harkinsです。Protein Discoveryのリサーチサイエンティストを務めています。本日は、新しいgel free 8, 100 Fractionationシステムを使用して、分子量に基づいた高回収率の分画をいかに簡単に実現できるかをご紹介します。

GelFreeを使用すると、1チャネルあたり最大1 mgの総タンパク質をロードでき、最大8つのサンプルを約90分で再現性良く分画することが可能です。本システムには、装置、使い捨てカートリッジ、および実験に必要なすべてのバッファーが含まれています。それでは、始めていきましょう。

まず、最大8本の500 µLチューブを準備し、それぞれにラベルを貼ります。最大112 µLの容量で、最大1 mgのタンパク質試料を添加します。試料中のタンパク質量は、試料の複雑さに応じて異なります。

本デモンストレーションで使用した組織ホモジネートのようなより複雑なサンプルの場合、1チャンネルあたり150〜200 µgで最良の結果が得られます。次に、ゲルフリーカートリッジキットに付属している5xサンプルバッファーを30 µL添加します。各タンパク質サンプルに、1 M DTTを8 µL添加します。

次に、各サンプルに水を加え、最終容量を150 microlitersに調整します。その後、バイアルを95 degrees Celsiusで5分間加熱し、サンプルを変性させます。加熱したサンプルを室温まで冷却してください。

GelFree 8, 100 カートリッジをアルミパウチから取り出します。プレートシーラーを取り除き、廃棄します。ピペットを使用して、カートリッジのコンパートメントから保存バッファーを除去します。

カートリッジの8つのチャンバーをすべて使用する場合、カートリッジを反転させてコンパートメントから保存バッファーを排出します。次に、各アノードバッファーリザーバーに8 mLのゲル電気泳動用バッファーを添加します。各カソードバッファーリザーバーには6 mLを添加し、各回収チャンバーには100 µLをピペッティングします。

8チャンネルの100〜200 µLピペッターを使用して、カソードバッファーリザーバーからサンプルローディングチャンバーに流れ出したバッファーを除去して廃棄し、直ちにサンプルをローディングチャンバーにロードします。サンプルのロードが完了したら、カートリッジをGelFree 8 100分画ステーションにセットします。次に、装置のタッチスクリーンディスプレイ上のプログラムが容易なグラフィカルユーザーインターフェースを使用して、電極アレイを下げて蓋を閉じ、利用可能なプリセットメソッドのリストに移動します。

メソッドボタンを押して、適切なメソッドを選択します。リトリーブボタンを押し、あらかじめプログラムされた希望のメソッド番号を入力してください。画面上のキーパッドを使用してOKを押します。その後、適用ボタンを押してください。

適用されたメソッドはメイン画面の下部に表示されます。あらかじめプログラムされた各メソッドは、特定の分子量範囲内のタンパク質を分離するように設計された、設定電圧と時間ベースのポーズで構成されています。適切なメソッドを選択したら、メイン画面のチャンネルボタンを押してください。

次に、ランで使用するチャンネルを選択します。8つすべてのチャンネルを選択するには、「すべて選択」を押してください。その後、「完了」を押します。

メイン画面に戻るには、セーフティリッドが閉じていること、および画面下部のインジケーターランプが緑色に点灯していることを確認してください。次に、「start」を押して実験を開始します。システムが作動している間、画面左側のボックス内に表示される円は、各チャネルの状態を示しています。緑色の円は、そのチャネルがアクティブであることを示します。

印加電圧および電流は、チャンネルステータスサークルの右側に表示されます。gel free 8, 100は、メソッドで指定された間隔で分画回収のために自動的に一時停止します。分画回収のために装置が一時停止すると、一時停止したことを知らせるテキストボックスが表示され、ステータスサークルが黄色に変わります。

カートリッジ内部では、アノードとカソードのリザーバー間に一定の電圧が印加されます。この電位下で、タンパク質混合物は電気泳動によってロードチャンバーから特別に設計された精密キャスト内へと移動します。タンパク質はまずスタッキングゲル内で鋭いバンド状に濃縮され、その後、リゾルビングゲルにおいてそれぞれの分子量に基づいて分離されます。

タンパク質がゲルから溶出すると、液相内で捕捉され濃縮されます。回収チャンバーはゲルを含みません。その後、装置を一時停止させます。

あらかじめ設定した時間間隔に基づき、ピペットを用いて画分を回収します。その後、目的とする2番目の分子量画分をトラップさせるために、再び電位を印加します。この工程を、目的とするすべての画分が回収されるまで繰り返します。

各カートリッジには8つの独立した電気泳動チャネルが含まれているため、ユーザーは必要なチャネル数だけを使用し、未使用のチャネルを後日使用するために残しておくことができます。フラクションを回収するには、装置の蓋を開き、内蔵のチャネルピペットを使用します。各回収チャンバーにある150 µLの液体を、回収チューブまたはマルチウェルプレートに移してください。

フラクションを除去した後、各チャネルに100 µLのgel free running bufferを加え、ピペッティングを2回繰り返して、回収チャンバーを2回洗浄します。洗浄後、回収チャンバーに100 µLのgel free running bufferを再び加えます。蓋を閉め、再開ボタンを押してください。

Gel Free 8, 100は次の時間間隔まで動作します。実験の残り合計時間は、画面の右側に表示されます。時間表示ボックスの上にあるボタンを押すと、残り時間、経過時間、および一時停止時間の表示を切り替えることができます。

すべての分画を回収した後、等電点電気泳動やゲル電気泳動などのさらなるダウンストリーム調製、あるいは液体クロマトグラフィー、質量分析、免疫親和性を用いた分析に直ちに使用できます。本デモンストレーションでは、各200 µgの8つのタンパク質サンプルをそれぞれ12分画に分画し、計96分画としました。分画の結果を可視化するため、ウシ肝臓ホモジネートサンプルの12分画からそれぞれ分注し、標準的な1Dゲルで電気泳動を行い、銀染色しました。

この図に示すように、タンパク質試料は3.5 kilodaltonsから150 kilodaltonsの分子量範囲にわたる12の独立したフラクションに分画されました。ここに示されたゲルは、gel free 8, 100システムが大量のタンパク質を明確な分子量フラクションに分画できる能力を強調しています。これは、質量分析を用いたトップダウンおよびボトムアッププロテオミクスだけでなく、単一の精製された完全なタンパク質分子量フラクションが必要な免疫親和性実験にとっても、極めて強力なツールとなります。

Gel Free 8, 100 分画システムを用いて、サンプルを特定の分子量画分に再現性高く分画し、高い液相回収率を得ることがいかに簡単であるかをご紹介できました。以上で解説を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。