乳腺上皮移植の手順

このビデオでは、乳腺上皮の採取、乳腺脂肪体の除去、および外来性上皮の移植の手順を実演し、3週齢のマウスにおける乳腺の発達を検討します。乳腺上皮樹の成長は乳頭付近に限定されており、脂肪体には乳腺上皮がほとんど存在しません。マウスが成熟するにつれて、上皮樹は脂肪体内へと成長します。

生後7週までに、上皮管樹は脂肪組織全体に広がります。もし生後3週の時点で上皮を含む脂肪組織の一部を除去した場合、内在性の上皮がメモリー脂肪組織に定着することはありません。この脂肪組織は「クリア（除去済み）」と定義され、成熟してもクリアな状態のままとなります。しかし、移植されたドナーのメモリー上皮または上皮細胞は、クリアなホスト内でメモリー管樹を拡張させる能力を持っています。

脂肪組織です。その後、組織学を用いて、トランスジェニック動物または試験動物から移植された組織における記憶形成の進行をモニタリングできます。こんにちは、ジョセフ・ジェリーです。マサチューセッツ大学の獣医学・動物科学科に所属しています。

こんにちは、カレン・ダンフィーです。私はジェリー研究室に所属しています。今日は、乳腺上皮移植を行います。

本手順を用いて、乳腺腫瘍の発生の分子および細胞学的基盤を研究し、乳がんモデルを作成します。それでは始めましょう。移植手順の最初のステップは、ドナーマウスから乳腺上皮組織を採取することです。

最近安楽死させた雌マウスを70% ethanolで洗浄することから始めますが、この際、腹腔内のSRU膜を突き破らないように注意してください。恥骨から胸骨まで、皮膚に正中矢状切開を加えます。次に、恥骨の最初の切開口から各後肢に向かって斜めに切開します。

曲がったピンセットを用いて、SRU膜を掴みます。次に、ストレートのセレーション付きピンセットを使用して、皮膚の切断端を掴み、体壁をS cs膜から慎重に剥離させます。

体壁の下側に付着している第4鼠径記憶腺を露出させるため、記憶腺内のリンパ節を確認します。このリンパ節は記憶腺内の3本の顕著な血管が交差する位置にあり、脂肪組織の中の硬い結節として触知できます。眼科用はさみの先端で、リンパ節周囲の脂肪組織をつまみ切ります。次に、皮膚の表皮側に人差し指を当て、リンパ節を脂肪組織から押し出すように圧力を加え、摘出します。

曲がった鉗子を用いて、リンパ節を除去します。次に、皮膚の端を保持しながら、曲がった鉗子の湾曲した端で乳腺脂肪体をつかみ、体壁から脂肪体を徐々に剥離させます。マウスの背側に向かって脂肪体の方向に沿って、乳腺全体を一度に摘出します。

メモリー腺を滅菌済みのプラスチック製カッティングブロック上に置き、腺の表面が乾かないよう、少量の培地（約200 µL）を滴下します。次に、新しいカミソリを用いて、腺を1 mm角に細切にします。細切にした腺を4等分に分けます。

次にピンセットを使用して、4本の凍結保存用チューブに分注し、凍結媒体を加えます。外槽に250 millilitersのイソプロピルアルコールを入れたNalgeneセルフリーザーに凍結保存用チューブを入れます。その後、セルフリーザーを-70 °Cで24時間保存します。

24時間後、凍結した記憶断片のバイアルを、移植に必要になるまで液体窒素で保存します。各クライオバイアルには、4～8匹のホストマウスの除去済み脂肪組織に移植するのに十分な量の記憶腺断片が含まれています。3週齢のホストマウスの足指を挟んで麻酔深度を確認した後、マウスを腹側が上になるように外科用ステージ上に固定し、肢を伸ばして腹部が緊張した状態にします。

術前鎮痛剤として、ブピバカインまたはブプレノルフィンを皮下に投与してください。鉗子を用いて、アルコールおよびヨード系スクラブで手術部位を消毒します。骨盤の数ミリ上の皮膚を掴み、腹部から持ち上げます。

皮膚を慎重につまみ、最初の切開が尿道に近すぎないように注意してください。傷口を閉じるクリップの配置が、マウスの排尿能力を妨げる可能性があるためです。次に、SRUの膜を突き刺さないように注意しながら、恥骨から胸骨に向かって皮膚を正中線に沿って切開します。

最初の切開部位から、正中線から骨盤を横切り、各後肢に向かって皮膚を斜めに切開します。曲線ピンセットを用いて、腹壁のS ceros膜をそっと掴みます。次に、組織ピンセットで皮膚の切開縁を掴み、体壁をceros膜から剥がします。

第4鼠径記憶腺を露出させるために、第4記憶腺を特定します。第5記憶腺を特定し、乳頭結節およびその結節に至る2本の動脈を焼灼します。第4腺と第5腺を分離し、次に第5腺の縁を焼灼します。

次に、ハサミを用いて、リンパ節のすぐ腹側の脂肪組織を横方向に切り、第4記憶腺の脂肪組織を分離します。曲がったピンセットを用いて、脂肪組織の腹側部分をしっかりと掴み、体壁から引き離します。切除した組織は、ラベルを貼った2枚のスライドガラスに挟み、カルノ固定液で固定することが推奨されます。

その後、組織を染色し、封入して、切除縁が十分に確保されているかを確認することができます。ピンセットを使用して、脂肪パッドの切除部位周辺にあるメモリー腺の痕跡をすべて取り除きます。これで、組織または細胞の移植が可能な状態になります。

新鮮または急速凍結したドナー上皮組織を、透明化した脂肪パッドに移植することができます。あるいは、不死化したメモリー上皮細胞株、メモリー腫瘍細胞株、または初代細胞を移植することも可能です。細胞調製の詳細については、上皮断片の移植に関する付属の書面プロトコルを参照してください。

このビデオでは、まず上皮の凍結保存バイアルを解凍し、断片を新鮮な培地 containing のペトリ皿に移します。DMSOを希釈するため、レシピエントマウスの除脂肪された脂肪パッド上皮にハサミでポケットを作成します。次に、針鑷子を用いて、ドナー上皮の1 mmの断片をそのポケット内に配置します。

必要に応じて、組織鉗子でポケットを閉じたまま保持し、組織がずれないように針鉗子を抜去します。皮膚の対向する縁を把持し、鉗子で合わせて保持します。

それらを腹腔の漿膜から持ち上げ、創傷クリップで閉鎖します。正中切開の閉鎖には2つのクリップを、各斜切開には1つのクリップを使用してください。必要に応じて、尿道を塞がないように注意してください。

正中切開と斜切開の交差部分にある皮膚の隙間を、縫合糸で閉鎖します。マウスをケージに戻し、マウスが意識を取り戻すまで、ケージを保温ランプの下に置いておきます。創傷用クリップは2週間後に除去してください。

以下のスライドは、給餌パッドの除去および上皮の移植後、宿主のメモリー腺に期待される代表的な画像を示しています。この画像は、3週齢のマウスから除去された内因性メモリー上皮を示しています。腺の除去手順において、切除縁が明確に除去されている点に注目してください。切除縁の状態を評価するために、各手順に続いてこのようなホールマウント標本を準備する必要があります。

この画像は、透明化処置から7週間後のマウスの透明化された脂肪体を示しています。脂肪体全体に、メモリー、上皮、ヘマチン、およびアシンが存在しないことに注意してください。透明化処置から7週間後の透明化された脂肪体の染色においても、腺にメモリー上皮が存在しないことが示されています。

10週齢のマウスからドナーメモリー上皮を移植した、透明化処理済み脂肪パッドの代表的なホールマウント像を示す。移植された上皮が正常な上皮管樹、ヘマチン、および腺房を形成していることに注目されたい。透明化処理済み脂肪パッドおよびメモリーの染色像。

同齢での上皮移植により、外来上皮から上皮管が正常に産生されることが明らかになります。ここでは、透明化した脂肪体をヘマチンおよびアシシンで染色し、記憶腫瘍へと発化した上皮移植片を示しています。以上で、乳腺上皮の採取および乳腺上皮移植の手法について説明しました。

この手順を実施する際は、第4腺と第5腺の間の接続を切断して結節と乳頭を焼灼し、内因性上皮の痕跡を完全に除去することが重要です。これにより、除去した脂肪組織の中に内因性上皮が再成長する可能性がないようにします。さらに、切除辺縁が十分に確保されているかを確認するため、切除した乳腺組織全体を採取することが推奨されます。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。