Name: 乳腺上皮移植の手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶ乳腺上皮移植の手法。マウスの乳腺脂肪パッドをクリアリングし、外来上皮を移植して乳腺発生を研究する。この方法により、上皮細胞の発達過程と乳がんモデルの構築が可能となる。

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1。移植上皮の準備新鮮または凍結ドナー上皮組織はクリア脂肪パッドに移植したが、凍結ドナー上皮の事前準備は、移植効率の最小限の低下（&gt; 85％の効率）とより便利ですできます。次のように凍結ドナー上皮の準備のためのプロトコルは、次のとおりです。 ドナーの移植の上皮を準備する前に、cryovialsに1ミリリットル約上皮、アリコートのために凍結するメディアを準備する。必要になるまでこれは、6ヶ月までは4℃で保存することができます。凍結メディアはDMEM/F12 HEPESおよびNaHCO 3で緩衝培地、10％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）が含まれています。 最近安楽死させた雌マウスから乳腺上皮を採取。 <ol><li> 70％EtOHでマウスを洗ってください。 </li><li>腹側体腔の漿液膜を貫通することなく、恥骨から胸骨に至る体壁を通して半ば矢状切断してください。各後肢（図1）に向かって恥骨で最初の切開から斜めのカットを行います。 </li><li>体壁の裏側に筋膜に接続された第 5 回鼠径部乳腺を公開するために離れて漿液膜から体壁ピール。これを達成する最良の方法はないピアス腹側の体腔に注意して、曲がったピンセットの湾曲部を慎重に漿液膜を把握することです。同時に、直線鋸歯状の鉗子と外皮のカットエッジをつかみ、漿液膜から体壁を引き出します。 </li><li>乳腺内のリンパ節を特定する。リンパ節は、乳腺の3つの主要な血管の交差点に位置し、脂肪パッド（図2）内に密度の高い小結節として感じることができる。目のはさみの先端で、ニップノードを取り巻く脂肪組織。皮膚の表皮側の人差し指で、脂肪パッドのノードの出力を高め、湾曲したピンセットでそれを挟まないように圧力を適用する。リンパ節を捨てる。 </li><li>皮膚のマージンを押しながら、曲がったピンセットの湾曲した縁で、徐々に体壁から脂肪パッドピール乳腺脂肪体を把握する。あなたが一体で全体乳腺を除去するように、マウスの背側表面に向かって脂肪パッドの方向に従ってください。 </li><li>滅菌プラスチックの切削ブロックで乳腺を置く。それは湿った保つために腺の表面に、200μlの程度、小容量のリムーバブルメディアを追加。新鮮なカミソリの刃で1mmの部分に腺を飾らない。 4つの部分にみじん切りの腺を分割し、鉗子で凍結メディアの4つのcryovials間で配布する。外側のコンパートメントにイソプロピルアルコールの250ミリリットルいるNalgene"ミスターフロスティ細胞の冷凍庫にcryovialsを置く。24時間70℃以下の冷凍庫でNalgeneの冷凍庫に入れて。ために必要になるまで液体窒素中に乳腺の断片の凍結バイアルを保存移植各クライオバイアルは4〜8宿主マウスのクリア脂肪パッドに移植するのに十分な乳腺のフラグメントが含まれます。 </li></ol> 2。移植細胞の調製私たちの研究室では、脂肪パッドをクリアマウスに不死化乳腺上皮細胞株、乳腺腫瘍細胞株またはプライマリ乳腺細胞を含むさまざまな種類の細胞を、移植しています。次のように移植するためのカンマ- D細胞の調製のためのプロトコルは、次のとおりです。 <ol><li>コンマ- D細胞は、DMEMを含む正規MECL培地で培養されています：F12、2％アダルト牛血清（ABS）、mEGF、インスリン、抗生物質/抗真菌剤（AB / AM）を補充した。 </li><li>収穫のカンマ- D細胞が85％-90％コンフルエントの細胞。 </li><li>細胞をペレットに5分間1200rpmで細胞懸濁液を遠心してください。新鮮なMECLメディアで細胞を再懸濁し、5 × 10 6個 / mlに細胞濃度を調整する。 </li></ol>主な乳腺細胞の移植のために、主要な乳腺上皮細胞はマウス5 番目の乳腺からの機械的および酵素的解離によって分離されています。 F12のメディアをして所望の濃度に調整し、通常5 × 10 6個 / ml：細胞は、DMEMに再懸濁する。 3。マウス乳腺脂肪体をクリアするための標準手順<ol><li>三週間、古いホストのマウスを麻酔。 &lt;12 gが乳管の成長が開始されていないことを保証するためであるマウスを選択します。我々は、2,2,2 - トリブロムエタノールの体重から200mg/kg使用。 </li><li>マウスに麻酔をした後に腹部が愚弄になるように、しっかりと手術のステージで、広げた手足と、腹側にマウスを抑制する。手術前に、鎮痛薬を管理し、ブピバカイン（&lt;1mg/kg）またはブプレノルフィン（0.05mg/kg）のどちらか、皮下。 </li><li>数ミリの骨盤上記鉗子で皮膚をつかみ、腹部からそれを持ち上げる 。ニップは、はさみで皮膚と恥骨から胸骨に至る体壁を通して半ば矢状カットを作るために。腹側体腔のピアス漿液膜はしないでください。創傷クリップが排尿するためにマウスの能​​力と干渉しないように、あまりにも尿道の近くに最初の切開を行わないでください。 </li><li>最初の切開から、各後肢に向かって骨盤全体の半ばラインから皮膚を通して斜めのカットを行います。 </li><li>優しく漿液膜を把握するために湾曲鉗子の湾曲した領域を使用します。皮膚のカットマージンをつかみ、漿液膜から体壁を引くと体壁の下側の筋膜上にある5 番目の鼠径部乳腺を公開する組織鉗子を使用してください。 </li><li>ニップル、ノードとノード（図2）に先頭に2つの動脈を焼灼する</li><li>第四および第五腺を区切ります。 6 番目の腺から内部成長を防ぐために、第五腺のマージンを焼灼する。 </li><li>ノードの（ニップルに向かって側）だけで腹をはさみで脂肪パッドを横断する4つ目の乳腺の脂肪パッドを割ります。しっかりと脂肪体の腹側部分を把握し、一枚で体壁からそれを引き離しに曲がったピンセットを使用してください。つのスライド間で脂肪体の腹側部分を押すと、カルノア固定液を含むガラスの組織学的染色皿に入れ。この組織は、クリアマージン（図3）を確認するために固定されており、カルミンのミョウバン液で後染色されます。湾曲鉗子で乳腺のすべての痕跡を除去する脂肪パッドの除去部分の領域の周囲の筋膜を清掃してください。 </li></ol> 4。脂肪パッドをクリアするための代替"スペアリングの手順いずれかのマウス乳腺脂肪パッドをクリアするための標準手順で有能になった後、彼らはブリルら （2008）2によって開発された低侵襲温存の手順を試みることを好むことがあります。 <ol><li>標準的な手順と同様にマウスを準備します。 </li><li>第四鼠径乳腺の乳首をつかみ、ハサミの先端で乳首の周りに3〜5ミリメ​​ートルの円周の円をカット。 </li><li>皮膚のカット部分を切り離し、穴から第四鼠径部乳腺を引き出すために離れて身体から乳首を引っ張る。 </li><li>ノードを識別します。スルーホールノードと6 番目の乳腺を焼灼するために焼灼を使用しています。 </li><li>単にノードの前に第 5 回乳腺の最も表面的な部分をカットして切り離す。ニップル、上皮を含む乳腺脂肪体の皮膚と部分の円形の領域が一体的に削除されます。 </li></ol> 5。組織/細胞移植<ol><li>上皮の破片、霜上皮のクライオバイアルを移植するとDMSOを希釈するために新鮮な培地を含むペトリ皿に上皮フラグメントを転送する。新しい上皮用はさみ先端とクリア脂肪パッドに小さな穴やポケットを作る。針の鉗子とポケットにドナーの上皮の1mmの部分を置く。組織の場所に残っているように、針の鉗子を撤回として組織鉗子で閉じてポケットホールド。 </li><li>細胞を移植するために、22秒計の針と50μlのハミルトンシリンジを用いて各脂肪パッドへのメディアの10μlに50,000個の細胞を注入する。 </li></ol> 6。閉会/マウスのリバイバル<ol><li>閉会のスキンを手配。皮膚のマージンを反対つかみ、、鉗子でそれらを一緒に押したまま腹体腔の漿液膜から離して持ち上げ、創傷クリップで閉じてください。一般的に、それは半ば矢状切開と標準的な手順については、各斜切開用のクリップを閉じるには、2つのクリップを使用する必要があります。尿道を閉塞することは避けてください。それは、縫合糸の半ばに矢状と斜切開の交差点で皮膚のギャップを埋めるために必要な場合があります。スペア手順は、各サイド用の創傷クリップが必要になります。 </li><li> 。彼女のケージにマウスを置いて、マウスが復活するまで加熱ランプの下にケージを保つ。 </li><li>創傷クリップは、2週間後に削除する必要があります。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。切開パターンのデモンストレーション。 <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2リンパ節、血管、乳頭および内因性上皮のロケーション。指定された場所で焼灼する。 <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ホールマウントは、その内因性上皮が円内の領域に限定し、したがって、マージンは""明確にされている証拠です。 7。代表的な結果_r.jpg"ALT ="図4"/&gt; 図4。消去のマージンを示す3週齢のマウスから取り外した脂肪パッドのホールマウント。 <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。内因性の乳腺上皮のクリア脂肪パッドを示す10週齢のマウスからの全マウント。 <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6 10週齢のマウスからクリア脂肪パッドのヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。 <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7。移植上皮から開発された正常な乳管ツリーを示す10週齢のマウスからの全マウント。 <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="図8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 図8。移植上皮から開発された乳管のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。 <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="図9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図9"> 図9。移植上皮から開発された乳腺腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片。

<ol><li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li>
<li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li>
<li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li>
<li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li>
<li>Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females%3A+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li>
<li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB%2Fc-Trp53%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li>
</ol>

このレポートでは、我々は、乳腺上皮移植の準備のためにマウス乳腺脂肪パッドをクリアするための2つの代替方法を提示する。標準的な手順はDeOme らによる1959年に開発から使用されています。1は、より侵襲が、乳腺の構造と配向が容易に閲覧されているため、標準的な方法は、初心者を訓練するための好ましい方法です。しかし、温存手続きがあるため、いくつかの利点2のより多くの経験豊富な外科医が好ましいことがある。最も重要なことは、スペアリングの手順は、低侵襲であるより少ない時間を必要とし、吸入麻酔の短い期間を使用して実行することができます。これはマウスのための回復期間が短縮されます。スペアリングの手順は、上皮の正常なクリアランスを確保する若いマウス（&lt;21日間）に行うことができます。さらに、実験では転移のためのマウスの継続的な長期的な観察を可能にするまだ、原発腫瘍を摘出する手術を繰り返す必要がある場合は有利かもしれない手術後の組織の癒着の減少がある。 手続きの移植部分は、乳腺の完全な発展が思春期後まで発生しないという事実を活用し...

乳腺上皮移植の手順

Mammary Epithelial Transplant Procedure

この記事ではDeOmeキロバイトら 1ブリルB らが開発温存手順によって開発された脂肪パッドのクリアランスの手順を説明し、比較する2、乳腺上皮移植の手続きが続く。それは乳腺上皮の著しい発展は、思春期後まで発生しないという事実が利用されるため乳腺移植の手順は、広く乳腺生物学者によって使用されます。生後3週で、乳腺上皮木の成長は、乳首の近傍に限定されていると脂肪パッドは、乳腺上皮の大部分を欠いているが、7週齢で上皮管ツリー全体脂肪体全体に拡張。したがって、上皮を含む脂肪パッドのこの小さな部分は、乳首やリンパ節の間の領域は、生後3週間で削除された場合、内因性上皮は乳腺脂肪体に移入することはありませんし、脂肪パッドは、&quot;クリアとして記述されています&quot;。この時点で、別のソースからの乳腺上皮は、それは脂肪体全体を通して乳管の木を拡張する可能性を秘めているクリア脂肪体に移植することができる。この手順は、決定、4,5限られた希釈で細胞を移植することにより、乳腺幹細胞の同定には、全体の動物の3遺伝子型の交絡影響することなくトランスジェニック乳腺上皮組織における腫瘍表現型の検査を含む多くの実験モデルで利用されている過形成結節は、乳腺腫瘍6に進みますし、乳腺上皮7,8の挙動に関する事前のホルモン暴露の影響を評価する場合。 三週齢の宿主マウスは、麻酔きれいにして外科的ステージに抑制。半ば矢状切開は恥骨から胸骨まで延びる、皮膚ではなく、腹膜を介して行われます。斜めカットは、それぞれの脚に向かって骨盤全体の半ばに矢状切開から皮膚を介して行われます。皮膚は4鼠径乳腺を公開するために離れて腹膜からプルされます。脂肪パッドは、リンパ節への脂肪パッドの組織の前方を削除することによってクリアされます。上皮のフラグメントまたは上皮細胞は、残りのクリア脂肪体に移植され、マウスが閉じられます。

この記事ではDeOme KBで開発した手順を示しています<em&gt;ら。</em&gt;（1959）とブリルBによって開発されたスペア手順<em&gt;ら。</em&gt;（2008）乳腺の断片、乳腺上皮細胞、または乳腺腫瘍細胞の移植の準備のために思春期のマウスの4番目の鼠径部乳腺脂肪体をクリアする。

本記事では、DeOme KBらによって開発された脂肪パッド除去法1と、Brill Bらによって開発された温存法2について記述し、比較検討する。

このビデオでは、乳腺上皮の採取、乳腺脂肪体の除去、および外来性上皮の移植の手順を実演し、3週齢のマウスにおける乳腺の発達を検討します。乳腺上皮樹の成長は乳頭付近に限定されており、脂肪体には乳腺上皮がほとんど存在しません。マウスが成熟するにつれて、上皮樹は脂肪体内へと成長します。生後7週までに、上皮管樹は脂肪組織全体に広がります。もし生後3週の時点で上皮を含む脂肪組織の一部を除去した場合、内在性の上皮がメモリー脂肪組織に定着することはありません。この脂肪組織は「クリア（除去済み）」と定義され、成熟してもクリアな状態のままとなります。しかし、移植されたドナーのメモリー上皮または上皮細胞は、クリアなホスト内でメモリー管樹を拡張させる能力を持っています。脂肪組織です。その後、組織学を用いて、トランスジェニック動物または試験動物から移植された組織における記憶形成の進行をモニタリングできます。こんにちは、ジョセフ・ジェリーです。マサチューセッツ大学の獣医学・動物科学科に所属しています。こんにちは、カレン・ダンフィーです。私はジェリー研究室に所属しています。今日は、乳腺上皮移植を行います。本手順を用いて、乳腺腫瘍の発生の分子および細胞学的基盤を研究し、乳がんモデルを作成します。それでは始めましょう。移植手順の最初のステップは、ドナーマウスから乳腺上皮組織を採取することです。最近安楽死させた雌マウスを70% ethanolで洗浄することから始めますが、この際、腹腔内のSRU膜を突き破らないように注意してください。恥骨から胸骨まで、皮膚に正中矢状切開を加えます。次に、恥骨の最初の切開口から各後肢に向かって斜めに切開します。曲がったピンセットを用いて、SRU膜を掴みます。次に、ストレートのセレーション付きピンセットを使用して、皮膚の切断端を掴み、体壁をS cs膜から慎重に剥離させます。体壁の下側に付着している第4鼠径記憶腺を露出させるため、記憶腺内のリンパ節を確認します。このリンパ節は記憶腺内の3本の顕著な血管が交差する位置にあり、脂肪組織の中の硬い結節として触知できます。眼科用はさみの先端で、リンパ節周囲の脂肪組織をつまみ切ります。次に、皮膚の表皮側に人差し指を当て、リンパ節を脂肪組織から押し出すように圧力を加え、摘出します。曲がった鉗子を用いて、リンパ節を除去します。次に、皮膚の端を保持しながら、曲がった鉗子の湾曲した端で乳腺脂肪体をつかみ、体壁から脂肪体を徐々に剥離させます。マウスの背側に向かって脂肪体の方向に沿って、乳腺全体を一度に摘出します。メモリー腺を滅菌済みのプラスチック製カッティングブロック上に置き、腺の表面が乾かないよう、少量の培地（約200 µL）を滴下します。次に、新しいカミソリを用いて、腺を1 mm角に細切にします。細切にした腺を4等分に分けます。次にピンセットを使用して、4本の凍結保存用チューブに分注し、凍結媒体を加えます。外槽に250 millilitersのイソプロピルアルコールを入れたNalgeneセルフリーザーに凍結保存用チューブを入れます。その後、セルフリーザーを-70 °Cで24時間保存します。24時間後、凍結した記憶断片のバイアルを、移植に必要になるまで液体窒素で保存します。各クライオバイアルには、4～8匹のホストマウスの除去済み脂肪組織に移植するのに十分な量の記憶腺断片が含まれています。3週齢のホストマウスの足指を挟んで麻酔深度を確認した後、マウスを腹側が上になるように外科用ステージ上に固定し、肢を伸ばして腹部が緊張した状態にします。術前鎮痛剤として、ブピバカインまたはブプレノルフィンを皮下に投与してください。鉗子を用いて、アルコールおよびヨード系スクラブで手術部位を消毒します。骨盤の数ミリ上の皮膚を掴み、腹部から持ち上げます。皮膚を慎重につまみ、最初の切開が尿道に近すぎないように注意してください。傷口を閉じるクリップの配置が、マウスの排尿能力を妨げる可能性があるためです。次に、SRUの膜を突き刺さないように注意しながら、恥骨から胸骨に向かって皮膚を正中線に沿って切開します。最初の切開部位から、正中線から骨盤を横切り、各後肢に向かって皮膚を斜めに切開します。曲線ピンセットを用いて、腹壁のS ceros膜をそっと掴みます。次に、組織ピンセットで皮膚の切開縁を掴み、体壁をceros膜から剥がします。第4鼠径記憶腺を露出させるために、第4記憶腺を特定します。第5記憶腺を特定し、乳頭結節およびその結節に至る2本の動脈を焼灼します。第4腺と第5腺を分離し、次に第5腺の縁を焼灼します。次に、ハサミを用いて、リンパ節のすぐ腹側の脂肪組織を横方向に切り、第4記憶腺の脂肪組織を分離します。曲がったピンセットを用いて、脂肪組織の腹側部分をしっかりと掴み、体壁から引き離します。切除した組織は、ラベルを貼った2枚のスライドガラスに挟み、カルノ固定液で固定することが推奨されます。その後、組織を染色し、封入して、切除縁が十分に確保されているかを確認することができます。ピンセットを使用して、脂肪パッドの切除部位周辺にあるメモリー腺の痕跡をすべて取り除きます。これで、組織または細胞の移植が可能な状態になります。新鮮または急速凍結したドナー上皮組織を、透明化した脂肪パッドに移植することができます。あるいは、不死化したメモリー上皮細胞株、メモリー腫瘍細胞株、または初代細胞を移植することも可能です。細胞調製の詳細については、上皮断片の移植に関する付属の書面プロトコルを参照してください。このビデオでは、まず上皮の凍結保存バイアルを解凍し、断片を新鮮な培地 containing のペトリ皿に移します。DMSOを希釈するため、レシピエントマウスの除脂肪された脂肪パッド上皮にハサミでポケットを作成します。次に、針鑷子を用いて、ドナー上皮の1 mmの断片をそのポケット内に配置します。必要に応じて、組織鉗子でポケットを閉じたまま保持し、組織がずれないように針鉗子を抜去します。皮膚の対向する縁を把持し、鉗子で合わせて保持します。それらを腹腔の漿膜から持ち上げ、創傷クリップで閉鎖します。正中切開の閉鎖には2つのクリップを、各斜切開には1つのクリップを使用してください。必要に応じて、尿道を塞がないように注意してください。正中切開と斜切開の交差部分にある皮膚の隙間を、縫合糸で閉鎖します。マウスをケージに戻し、マウスが意識を取り戻すまで、ケージを保温ランプの下に置いておきます。創傷用クリップは2週間後に除去してください。以下のスライドは、給餌パッドの除去および上皮の移植後、宿主のメモリー腺に期待される代表的な画像を示しています。この画像は、3週齢のマウスから除去された内因性メモリー上皮を示しています。腺の除去手順において、切除縁が明確に除去されている点に注目してください。切除縁の状態を評価するために、各手順に続いてこのようなホールマウント標本を準備する必要があります。この画像は、透明化処置から7週間後のマウスの透明化された脂肪体を示しています。脂肪体全体に、メモリー、上皮、ヘマチン、およびアシンが存在しないことに注意してください。透明化処置から7週間後の透明化された脂肪体の染色においても、腺にメモリー上皮が存在しないことが示されています。10週齢のマウスからドナーメモリー上皮を移植した、透明化処理済み脂肪パッドの代表的なホールマウント像を示す。移植された上皮が正常な上皮管樹、ヘマチン、および腺房を形成していることに注目されたい。透明化処理済み脂肪パッドおよびメモリーの染色像。同齢での上皮移植により、外来上皮から上皮管が正常に産生されることが明らかになります。ここでは、透明化した脂肪体をヘマチンおよびアシシンで染色し、記憶腫瘍へと発化した上皮移植片を示しています。以上で、乳腺上皮の採取および乳腺上皮移植の手法について説明しました。この手順を実施する際は、第4腺と第5腺の間の接続を切断して結節と乳頭を焼灼し、内因性上皮の痕跡を完全に除去することが重要です。これにより、除去した脂肪組織の中に内因性上皮が再成長する可能性がないようにします。さらに、切除辺縁が十分に確保されているかを確認するため、切除した乳腺組織全体を採取することが推奨されます。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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本稿では、レシピエント動物の間肩甲膜白色脂肪パッドにドナーラット乳腺上皮細胞を移植する移植方法について説明する。この方法は、乳腺上皮発生に対する宿主および/またはドナーの影響を調べるために使用することができ、事前にクリアする必要がなくなり、この技術の有用性を拡張する。...

間肩甲膜白脂肪パッドへのラット乳腺上皮細胞移植

患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび移植可能な遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患を忠実に再現し、基礎的および翻訳的な乳癌研究のための好ましいモデルである。ここで、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整形移植して腫瘍生物学を研究し、薬物反応を評価する方法について説明する。...

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。...

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

ここでは、胸筋インプラント前の乳房再建を伴う単一の腋窩切開による内視鏡的両側乳頭温存乳房切除術の詳細な外科的処置を紹介します。この手順は、乳がん患者にとって安全で実行可能な方法です。...

内視鏡的両側乳頭温存乳房切除術 単一の腋窩切開による即時胸前インプラントベースの乳房再建術

本研究は、少量の乳腺組織から初代ヒト乳腺上皮細胞(HMEC)を効率的に分離し、増殖するための、より簡単で時間を節約し、経済的なプロトコルを報告しています。このプロトコールは、実験室および臨床アプリケーションの両方で一次HMECを迅速に製造するのに適しています。...

初代ヒト乳腺上皮細胞の単離と培養

学ぶ乳腺上皮移植の手法。マウスの乳腺脂肪パッドをクリアリングし、外来上皮を移植して乳腺発生を研究する。この方法により、上皮細胞の発達過程と乳がんモデルの構築が可能となる。

乳腺上皮移植の手順

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