Name: マウス卵母細胞の検索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶPeromyscus属のマウスから卵母細胞と初期胚を回収する方法。卵管の漏斗部へのFHM培地注入と顕微解剖技術を用いて、遺伝子発現研究やトランスジェニック研究のための細胞を効率的に分離する再現性の高いプロトコルです。

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私は彼の助け、忍耐および知識のためにPeromyscus遺伝子ストックセンターからマイクデューイに感謝いたします。

胚/卵検索<ol><li>胚/卵母細胞の取得に先立って、KSOMが37℃CO 2インキュベーターとFHMに配置され、少なくとも2時間は-20℃から解凍する必要があります。 three凹面浅い井戸を含むガラス皿は、インキュベーターのKSOMの家降下するために使用されます。脱水を防ぐために、KSOMと皿は、底部に水を持っている蓋付き容器内に配置されています。この装置は、鉱物油を使用せずに蒸発を防ぎます。 </li><li>排卵雌から卵管は、FHMのメディアに配置されます。向きとそのままinfindibulumを確保するために、卵巣の小さなセクションは子宮の卵管と小さなセクションと一緒にカットされます。鈍30ゲージの針をinfindibulumに鈍針を挿入して卵管から胚/卵母細胞を追放するために使用されます。卵管が通過するために針には小さすぎるので、infindibulumは胚を取り出すために使用されている必要があります。 infindibulumが破壊されるイベントでは、卵管は、オープンスライスまたは胚は押し出されている必要があります。 </li><li>胚/卵母細胞はペトリ皿の底に沈んでいる脂肪滴の顕微鏡を集中さFHMのメディアに記載されています。これは高倍率より大きい表示領域を提供するので、胚/卵母細胞の分離は20倍で達成することができます。胚/卵母細胞はその周りに明確なリングを持っている丸い脂肪滴のようになります。キャピラリー引っ張らガラスを使用して、口の中のピペッティングは、、インキュベーションおよびさらなる操作のためのKSOMに胚/卵母細胞を移動するために使用されます。 </li></ol>卵母細胞の回収のための手順準備<ol><li> FHMを解凍し、kSOMを準備。 </li><li>数時間前の、底の水とチップボックス、CO 2インキュベーター内の場所での採卵容器と場所の場所のkSOM。 </li><li>ラボにケージを持参し、収穫の女性を殺す。 </li><li>あなたが卵管の一部を切断しないように卵巣の一部と子宮の一部をカットするように注意して卵管を切り取る。 </li><li>小さなペトリ皿にFHMのメディアの場所。 </li><li>フラッシングに使用されるより多くのカップルFHMメディアシャーレを注ぐ。 </li></ol>フラッシング<ol><li>スパイラルの最後で1ミリリットルの針に接続されているフラッシュを針（30ゲージ鈍）を使用してください。 </li><li>一度に卵を取り、針を用いて、卵巣の一部付近にある漏斗への挿入が接続されているまま。漏斗が破壊され、使用できない場合は、2つの鉗子を取ると卵管の一端を保持する。他のforcepで、優しくどんな胚のを取り出すために、歯磨き粉のチューブのように、絞る。 注：組織の多くは、それが付属しますので、これは、ペトリ皿の混乱を大量に作成しますので、その後別のペトリ皿を使用することがあります。 </li><li>胚を表示するには、脂肪部分に顕微鏡を集中し、その周りに透明な丸と丸&quot;脂肪部分&quot;を探します。 注：胚は、脂肪と同じ外観を持っているので、見つけるのは難しいかもしれません。胚が底に沈むので、そちらを参照してください。 </li><li>受信者の女性の膣スメアを実行してください。この段階で、彼らが偽でなければなりません。 </li></ol>

この記事では、排卵誘発（過排卵）Peromyscusから卵母細胞の取得を示しています。排卵の使用は、（のような自然の発情周期とは対照的に）ため、はるかに大きい結果の数値に共通です。しかし、注意が排卵して培養を誘導するために使用されるホルモンの両方が影響を与えることがあるとして、そのような卵母細胞/胚を利用した結果の解釈には注意が必要です。 発情が確認されたとき、女性はeuthenizedと卵管は卵巣のごく一部と一緒に回収されます。卵巣の小さな領域がinfindibulumの場所のためのマーカーとして使用されます。 infindibulumは、組織の薄い層を介して投影し、しばしば回、卵巣の隣に座っている。この組織の他の側では、卵管の残りの部分は、コイル状であり、最終的には膣に導く。卵母細胞を抽出するinfindibulumを通して流体をプッシュするのが最善です。この方向は、原因で膣卵管のインターフェースにある一方通行のバルブに必要です。それらはバルブを逆方向に投影している場合は卵母細胞は損害を被ることがあります。 30 gaugle平滑末端の針はinfindibulumに挿入されます。平滑末端の針はinfindibulum開口部に適合しますが、卵管チ...

<table><tbody><tr><td>フラッシングニードル</td><td>ツール</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G blunt</td></tr><tr><td>ピンセット (2)</td><td>ツール</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>動物</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ツール</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>FHM HEPES緩衝培地</td><td>試薬</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>KSOM胚培養培地 (5x 10 mL)</td><td>試薬</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>口ピペット</td><td>ツール</td><td></td><td></td><td>ガラスキャピラリーを延伸し、ゴムチューブに取り付けたもの</td></tr><tr><td>卵母細胞保持皿</td><td>ツール</td><td></td><td></td><td>凹みのあるガラス容器</td></tr></tbody></table>

マウス卵母細胞の検索

Retrieval of Mouse Oocytes

日付に、唯一の研究はほとんどPeromyscus胚発生や生殖生物学の成功した操作を報告している。一緒にPeromyscus遺伝子ストックセンター（http://stkctr.biol.sc.edu）と、我々はこのシステムを開発するために必要な顕著な違いが予想されています。主な目標は、卵母細胞/初期胚の取得を最適化してきました。

このプロトコルは、マウスの卵管から卵母細胞や初期段階の受精卵を抽出する手法を示しています。 infindibulumを識別し、それに平滑末端の針を挿入する機能が正しく手順を実行するために不可欠です。

現在まで、Peromyscusの胚発生または生殖生物学の操作に成功したと報告している研究はわずかです。Peromyscus...と共に、

私の名前はAmanda dliです。カリフォルニア大学アーバイン校のPaul Verana博士の研究室に所属しています。本日は、卵子回収の手順について解説します。これには、雌からvidexを分離させる工程が含まれます。ovexを分離させた後、videxにFHM培地を注入すると、子宮からcytesが排出されます。その後、培地中のcytesを分離し、今後の実験に使用します。この手順は、細胞の単離に加えて、特定の時点における胚の単離にも活用できます。この手順をビデオ形式で確認することをお勧めする理由の一つは、卵管の各部位の判別が非常に困難な場合があるためです。このビデオでは、FHM培地を注入する部位である漏斗部について説明します。使用する解剖器具は、鋭いピンセット2セットと鋭い鋏1本です。雌から採取した卵管を、35 mmの組織培養ディッシュに入ったFHM培地に置きます。卵は1 mLシリンジに取り付けた30 mmの鈍端針を用いて回収し、卵管は鋭いピンセットで固定します。FHMは細胞の回収に使用される保持培地です。KSOMは、受精した細胞をインキュベーター内で培養するために使用される培地です。卵子と胚を輸卵管から回収した後、キャピラリーチューブから作製しチューブを接続したガラス転写ピペットを用いて、口ピペットで保持培地へと移します。胚と卵を保持するために、ガラス製凹型ディッシュを使用します。これらを各凹円の中に配置することで、個別の場所に保持され、見つけやすくなります。このディッシュを容器に入れることで、オイルを使用せずにCO2インキュベーターに入れることができます。使用する培地に応じて、FHM培地またはKSOMの上に、ベースに水を入れ、タップを閉じて液体を保持させます。毛などが混入しないよう、70% ethanolを使用します。腹部領域に小さな切開を加え、腹腔内に切開を入れます。切開口を広げて腹部領域を露出させます。子宮を露出させるためにこれを行い、腸を脇に寄せると、その下に子宮が見えてきます。子宮はY字型をしており、子宮の一部を慎重に切り取ります。切断すると、輸卵管はスパゲッティのような外観になります。ここから輸卵管の一部を採取します。輸卵管と、脂肪に包まれた卵巣の一部を採取します。反対側も同様に行います。ここでも、卵巣または子宮を採取します。ここで子宮を掴み、付着点の下で切断します。この時点で輸卵管が確認できます。OV卵巣の一部を採取します。その後、これを培地に置きます。子宮はまだ収縮しています。子宮は平滑筋で構成されているため、体から切り離された後でもニューロンは活動し続けています。ここに子宮を示します。卵管はスパゲッティのような形状をしており、その上方に卵巣がありますが、実際には卵管は卵巣に付着していません。現時点では卵巣の一部のみを示していますが、私は右利きであるため、30ゲージの鈍端針を右手に持っています。これをピンセットのように使い、管（in fibula）を単離します。単離後、鈍端針を管に刺入し、液体を注入すると、それが子宮から流出します。左手で鋭いピンセットを持ちます。これは腓骨を単離し、すべてを固定するために使用します。ここで単離されるampullaは、ラッパのような形状をしています。針先を腓骨に刺し、組織層を貫通させます。次に、すべての胚と卵を確実に分離させるため、子宮を歯磨き粉のチューブのように絞り出します。その後、脂肪体（ファットパッド）に注目し、完全に左右対称に見える脂肪滴のようなものを探します。ちょうどその太い部分の左側に1つあります。これが単一の卵です。そこで、マウスピペットを用いて卵を吸い上げ、卵自体を単離するために、さらに保持培地の中に入れます。本日は、雌の生殖管から細胞を単離する方法について説明しました。また、卵管のさまざまな構造についても解説しました。特に、FHM培地を注入できる唯一の構造である漏斗部について説明しました。30ゲージの針を用いて採取します。この手法により、雌の生殖道内に存在する卵母細胞および胚を単離することができました。これらは遺伝子発現解析やトランスジェニック研究に使用可能です。

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生物学

卵母細胞が減数分裂成熟中に染色体の分離の誤差による異数性になりやすいです。異数体卵は不妊、流産やダウン症などの発達障害を引き起こす可能性があります。ここでは、卵母細胞と減数分裂成熟を研究し、倍数性を評価する方法に選択の材料を導入する方法を説明します。...

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

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マウス胞卵子の単離:新たに収穫されたマウス卵巣から胞卵子を単離する方法

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siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

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哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II...

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

近赤外フェムト秒レーザーを用いた中期I期にマウス卵母細胞の細胞質微小管組織化中心の枯渇を可能にする最適化されたプロトコルを提示します。...

マウス卵母細胞における細胞質微小管組織化中心の多光子レーザーアブレーション

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マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

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マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

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マウス卵母細胞の体外成熟、受精、着床前胚の培養

この映画とプロトコルは、核移植を学習することを目的としています。...

マウス卵母細胞への核移転

学ぶPeromyscus属のマウスから卵母細胞と初期胚を回収する方法。卵管の漏斗部へのFHM培地注入と顕微解剖技術を用いて、遺伝子発現研究やトランスジェニック研究のための細胞を効率的に分離する再現性の高いプロトコルです。

マウス卵母細胞の検索

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