マウス卵母細胞の検索

私の名前はAmanda dliです。カリフォルニア大学アーバイン校のPaul Verana博士の研究室に所属しています。本日は、卵子回収の手順について解説します。

これには、雌からvidexを分離させる工程が含まれます。ovexを分離させた後、videxにFHM培地を注入すると、子宮からcytesが排出されます。その後、培地中のcytesを分離し、今後の実験に使用します。

この手順は、細胞の単離に加えて、特定の時点における胚の単離にも活用できます。この手順をビデオ形式で確認することをお勧めする理由の一つは、卵管の各部位の判別が非常に困難な場合があるためです。このビデオでは、FHM培地を注入する部位である漏斗部について説明します。

使用する解剖器具は、鋭いピンセット2セットと鋭い鋏1本です。雌から採取した卵管を、35 mmの組織培養ディッシュに入ったFHM培地に置きます。卵は1 mLシリンジに取り付けた30 mmの鈍端針を用いて回収し、卵管は鋭いピンセットで固定します。

FHMは細胞の回収に使用される保持培地です。KSOMは、受精した細胞をインキュベーター内で培養するために使用される培地です。卵子と胚を輸卵管から回収した後、キャピラリーチューブから作製しチューブを接続したガラス転写ピペットを用いて、口ピペットで保持培地へと移します。

胚と卵を保持するために、ガラス製凹型ディッシュを使用します。これらを各凹円の中に配置することで、個別の場所に保持され、見つけやすくなります。このディッシュを容器に入れることで、オイルを使用せずにCO2インキュベーターに入れることができます。

使用する培地に応じて、FHM培地またはKSOMの上に、ベースに水を入れ、タップを閉じて液体を保持させます。毛などが混入しないよう、70% ethanolを使用します。腹部領域に小さな切開を加え、腹腔内に切開を入れます。

切開口を広げて腹部領域を露出させます。子宮を露出させるためにこれを行い、腸を脇に寄せると、その下に子宮が見えてきます。子宮はY字型をしており、子宮の一部を慎重に切り取ります。

切断すると、輸卵管はスパゲッティのような外観になります。ここから輸卵管の一部を採取します。輸卵管と、脂肪に包まれた卵巣の一部を採取します。

反対側も同様に行います。ここでも、卵巣または子宮を採取します。ここで子宮を掴み、付着点の下で切断します。この時点で輸卵管が確認できます。

OV卵巣の一部を採取します。その後、これを培地に置きます。子宮はまだ収縮しています。

子宮は平滑筋で構成されているため、体から切り離された後でもニューロンは活動し続けています。ここに子宮を示します。卵管はスパゲッティのような形状をしており、その上方に卵巣がありますが、実際には卵管は卵巣に付着していません。

現時点では卵巣の一部のみを示していますが、私は右利きであるため、30ゲージの鈍端針を右手に持っています。これをピンセットのように使い、管（in fibula）を単離します。単離後、鈍端針を管に刺入し、液体を注入すると、それが子宮から流出します。

左手で鋭いピンセットを持ちます。これは腓骨を単離し、すべてを固定するために使用します。ここで単離されるampullaは、ラッパのような形状をしています。

針先を腓骨に刺し、組織層を貫通させます。次に、すべての胚と卵を確実に分離させるため、子宮を歯磨き粉のチューブのように絞り出します。その後、脂肪体（ファットパッド）に注目し、完全に左右対称に見える脂肪滴のようなものを探します。

ちょうどその太い部分の左側に1つあります。これが単一の卵です。そこで、マウスピペットを用いて卵を吸い上げ、卵自体を単離するために、さらに保持培地の中に入れます。

本日は、雌の生殖管から細胞を単離する方法について説明しました。また、卵管のさまざまな構造についても解説しました。特に、FHM培地を注入できる唯一の構造である漏斗部について説明しました。

30ゲージの針を用いて採取します。この手法により、雌の生殖道内に存在する卵母細胞および胚を単離することができました。これらは遺伝子発現解析やトランスジェニック研究に使用可能です。