空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

嗅上皮の調製物を皿に取り付け、加湿空気の流れに入れる。解剖顕微鏡下では、参照電極が緩衝液を介して組織に電気的に接続されています。記録電極を嗅上皮の表面に配置します。

嗅上皮は、コンピューター制御の匂い物質パフによって加湿された空気の流れに投与され、匂い物質が嗅上皮に運ばれます。EOG信号は、アンプとデジタイザを介して記録コンピュータに送信されます。こんにちは、私はジョンズホプキンス大学生物学部の衛生XO研究所のキャサリン・シアールです。

今日は、マウスのエレクトロオルフファクトグラムを記録する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、匂いに対する嗅覚ニューロンの応答を研究しています。それでは始めましょう。

記録装置は、記録電極、参照電極、空気送達管、試料ステージ、解剖顕微鏡で構成されており、これらはすべてファラデーケージ内のエアテーブルに固定されています。マイクロメートルマニピュレータは、空気供給チューブ内の電極の配置に使用されます。連続的な気流が蒸留水を通して泡立てられ、湿度が加えられてから、空気供給チューブを通過して試料の上を通過します。

6〜8mmに適応するようにサードを充填した60mmの培養皿を標本の取り付け面として使用します。井戸と水路は、取り付け皿のガードからくり抜かれています。改質リンガー溶液を介して参照電極を試料に電気的に接続する手段を提供すること。

記録電極と参照電極はアンプに接続されています。アンプからの信号はデジタイザに送られ、次にコンピュータに送られます。XIグラフソフトウェアは、刺激プロトコルの制御、信号の記録、および応答の分析に使用されます。

オシロスコープは、記録電極を配置しながら電位をリアルタイムで監視するために、アンプの後に接続されています。そしてEOGレコーディング中。匂い刺激の送達は、匂い刺激を送達する直前に信号取得に使用されるのと同じコンピュータに接続されているピコスプリッツァーによって制御されます。

ピコスプリッツァーの出力は、液体臭気物質を含む臭気剤ボトルに接続されています。その後、ボトルは空気供給チューブに接続されます。それでは、実験を記録するための電極の作り方を見ていきましょう。

記録電極は、変性リンガー溶液で満たされた引っ張られたガラス毛細管内の塩化銀線です。参照電極は塩化物銀線です。電極ホルダーに銀線を取り付けて、両方の電極の準備を開始します。

記録電極の場合、電極ホルダーの端から1〜2センチメートルのワイヤーが突き出ている必要があります。参照電極には、より多くのワイヤーを残すことができます。塩化銀コーティングを追加するには、ワイヤを0.1モルの塩化ナトリウムに配置し、電極ホルダーを1.5〜9ボルトのDC電源のプラス端子に接続します。

電源のマイナス端子は、0.1モルの塩化ナトリウム溶液に電気的に接続する必要があります。反応中の塩化物を10分間進行させて、記録と参照電極の間の静電荷を均等化します。電極を記録装置に取り付ける前に、電極に軽く触れてください。

次に、マイクロピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーを引っ張ります。キャピラリーの先端の開口部は、直径が約5〜10ミクロンである必要があります。ダイヤモンドペンシルを使用して、キャピラリーの鈍い端に切り込みを入れて切断し、銀線よりも約2センチ長くなるようにします。

ブタントーチを使用して火を磨き、カットエンドを改質リンガー溶液で0.5%アグロスを溶かします。トランスファーピペットを使用して、加熱して引っ張って端が細くなるようにした注射器を使用して、少量の溶融アグロ溶液を電極の先端に引き込みます。引っ張ったキャピラリーを約半分ほど満たします。

改質されたリンガー溶液を使用して、キャピラリーを静かにフリックして気泡を取り除きます。充填した電極を、使用する準備ができるまで、少量の改質リンガー溶液を底に含ませて保存ジャーに保管します。組織サンプルが準備され、記録の準備ができたら、電極が準備された状態で、記録電極ワイヤー上に充填されたキャピラリーを取り付けます。

記録用の組織の準備を開始するための記録実験を見てみましょう。犠牲にされたマウスの頭蓋骨を覆う皮膚を取り除き、正中線に沿って頭を二等分し、頭の内側を上にして取り付け皿に取り付けます。鼻甲介を露出させるために中隔を慎重に取り外します。

ティッシュを取り付けた皿を録音ステージに置きます。鼻甲介の記録位置が顕微鏡の中央にくるようにステージを合わせます。次に、エアタンクをオンにして、毎分約600ミリリットルの加湿空気を鼻甲介の表面に供給します。

エアデリバリーチューブを記録場所から約10ミリメートル離して配置します。をセットします amplifierACモードに ampeEOG信号にアーティファクトを誘発するため。1 キロヘルツのローパス フィルターと 100 x のゲインで集録します。

次に、記録電極と参照電極をマイクロマニピュレータに取り付けます。参照電極を取り付け皿のウェルに下げ、組織に電気的に接続されるように修飾リンガー溶液で覆います。記録電極を鼻甲介2Bまたは3の表面に慎重に下げます。

電極は嗅上皮の表面にほとんど触れてはいけません。電極が上皮に接触すると、オシロスコープにまっすぐなベースラインが表示されます。次に、コンピューターのエアデリバリーチューブのサイドポートに臭気ボトルを取り付けます。

刺激プロトコルを開始します。データ集録のサンプリングレートは、2キロヘルツ以上である必要があります。ソフトウェアは臭気パルスをトリガーし、録音を開始します。

典型的な刺激プロトコルは、100ミリ秒の持続時間、1つのパルス対、1秒間隔で分離された100ミリ秒のパルス、または10秒の持続パルスであり得る。適応を最小限に抑えるために、高濃度の臭気を投与した後、プロトコル間で1〜5分かかります。チューブ内に残臭が残る場合がありますので、エアチューブを95%エタノールで洗浄し、乾燥させてから、追加の組織サンプルを調製してください。

Axo glotソフトウェアは、EOG信号の主要なパラメータを測定するためのツールを提供します。このようなパラメータには、応答振幅、レイテンシ、ピークまでの時間、および終端の時定数が含まれます。EOGのいくつかのパラメータは、応答振幅、潜時立ち上がり時間、ピークまでの時間、終了の時定数など、マウス間の正規化された応答の比較に特に役立ちます。

ここに示されているのは、液体酢酸アミルの濃度が増加すると刺激に応答するマウスのOGです。上部の黒い線は、ニオイ物質を刺激するタイミングと持続時間を示しています。ここでは、5匹のマウスから平均化された用量反応関係が95%信頼区間であることがわかります。

ピーク振幅の低下は、臭気濃度が非常に高い場合によく観察されます。対になったパルス刺激に応答したEOGの一例は、匂い物質の単一の短いパルスが数秒間持続する適応を誘発することを示している。ここに示されているのは、10秒間の持続的な臭気刺激に反応するEOGです。

EOGは、継続的な臭気物質の提示中に脱感作を示します。マウスの電極因子グラムを記録する方法を紹介しました。この手順を実行するときは、電極を上皮の表面だけに配置し、表面の下の電極を貫通しないように注意することが重要です。

常にヘッドの同じ側から記録し、バラツキを最小限に抑えるためにセットアップの変更を避け、組織を湿らせますが、液滴を溜めることなく、解剖直後に組織を加湿空気の下に置くと、組織を記録に最適な状態に保ちます。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。