Name: 空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-02T17:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶ マウス嗅覚上皮からの電気嗅覚図（EOG）記録法。加湿空気流中で嗅覚神経細胞の応答を電極で測定し、臭気物質刺激による電気生理学的応答をリアルタイムで解析する信頼性の高い手法です。

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我々は、博士益君の歌、そして生物学科、助言および助けのためのジョンズホプキンス大学のHattar Kuruvilla趙三研究室のメンバーに感謝。 NIHの助成金DC007395とDC009946によってサポートされています。

パート1。 EOGレコーディングのセットアップ記録装置は、記録電極、参照電極、空気供給管、試料ステージ、および解剖顕微鏡、すべてのファラデーケージ内の空気のテーブルの上にアンカーで構成されています。マイクロマニピュレーターは電極の配置と空気の配信チューブに使用されます。連続的な空気の流れは、空気供給管を通って試料上に渡す前に、湿度を追加するには、蒸留水バブリングされています。 6〜8ミリメートルの深さにSylgardで満たされた60mmの培養皿は、試験片の取付け面として使用されます。よくとチャネルは電気的に変更されたリンゲル液を経由して試料に参照電極を接続するための手段を提供するために取り付け皿にSylgardがくり抜かれている。 記録電極と参照電極は、アンプに接続されています。アンプからの信号がデジタイザにし、コンピュータに送信されます。このようなAxographやpClampなどのソフトウェアは、信号を記録し、そして反応のその後の分析のために、刺激のプロトコルを制御するために使用することができます。 EOG記録時の​​記録電極を配置しながら、アンプの後に接続してオシロスコープには、電位のリアルタイム監視に便利です。 嗅覚刺激の配信は、信号収集に使用したのと同じコンピュータに接続されているPicospritzer、によって制御されます。 Picospritzerでの空気の圧力は10 psiに設定されています。単一の空気タンクとレギュレータは、エアテーブルとPicospritzer両方に空気を供給するために使用することができます。第2空気タンクとレギュレータは、これはより低い圧力と空気の流れを大量に必要とするよう、加湿空気の流れのために空気を提供するために使用されます。匂い刺激を提供する直前に、Picospritzerの出力は、匂いのボトルに接続されています。匂いのボトルは、空気供給管に接続されています。 第2部：準備電極記録電極は、プルアップガラス修正リンゲル溶液（135 mMのNaCl、5mMのKClを、1mMのCaCl 2、1.5mMのMgCl 2、10mMのHEPES、pH7.4の、フィルター滅菌）で満たされたキャピラリー内chlorided銀線です。参照電極はchlorided銀線です。 <ol><li>電極ホルダーに銀線を取り付けます。記録電極の場合は、ワイヤ1〜2センチ電極ホルダーの端から突出してください。より線は、参照電極のために残すことができます。 </li><li>銀線に塩化銀のコートを追加するには、0.1 M NaCl中でワイヤを配置し、1.5から9 V DC電源の正端子に電極ホルダーを接続してください。電源の負端子は電気的に0.1 M NaCl溶液に接続する必要があります。 10分間進行さchloriding反応を可能にする。記録と参照電極との間の静電気を均等化するために、一時的に記録装置にインストールする前に一緒に電極に触れない。 </li><li>マイクロピペットプラーを使用してガラスキャピラリーを引き出します。キャピラリーの先端の開口部は直径5〜10ミクロン前後となるはずです。 </li><li>それは銀線より〜2センチメートル長くなるようにキャピラリーの平滑末端を獲得し、オフブレークするダイヤモンドの鉛筆を使用してください。ブタンのトーチと切断端を火磨く。 </li><li>修正リンゲル溶液に0.5％アガロースを溶かす。トランスファーピペットを用いて電極の先端部に溶融アガロース溶液の少量を引き出します。 </li><li>修正されたリンゲル液（この目的のために有用である加熱と長い細い端を持つように引っ張られているシリンジ）との双方向の約1 / 2プルキャピラリを埋める。ゆっくりと気泡を取り除くために、キャピラリーをフリック。彼らが使用できるようになるまで底で修正されたリンゲル液を少量保存瓶に充填された電極を保管してください。組織サンプルは、準備と録音の準備が完了したら、記録電極線上に塗りつぶされたキャピラリをインストールしてください。 </li></ol>パート3：準備嗅覚ソリューション着臭剤アミルアセテートとheptaldehydeが大きな応答を呼び起こすため、EOG興奮剤として適しています。 <ol><li>マイクロ遠心チューブに、ジメチルスルホキシド（DMSO）の匂いの希釈系列を用意する。用量反応曲線の開始点として、× 10 -6 M、5 Mから5〜10倍希釈液を調製毎日新鮮な希釈を行う。 </li><li>さらにシリコンのストッパー付き2オンスボトルの4.9 MLSの水とDMSO中に100μLの希釈株を混合して水に50倍に付臭剤を希釈する。ソリューションは、少なくとも30分間ボトルで平衡化してみましょう。それぞれのボトルの匂いの蒸気濃度が不明であることに注意してください、しかし液相中の臭気物質の濃度の関数として変化します。 </li><li> pにシリコン栓を介して2台の18ゲージの針を挿入する入力ポートと出力ポートをrovide。ボトルを使用していないときにポートは接続する必要があります。 </li></ol>パート4：EOGを記録し、データを分析する<ol><li>断頭続いてCO 2安楽死または麻酔薬過剰投与により、マウスを生け贄に捧げる。頭蓋骨を覆う皮膚を削除し、sagittally正中線に沿って頭を二等分する。 </li><li>取付け皿に、頭の半分、内側をマウントします。慎重に甲を公開するために隔壁を削除します。 </li><li>記録ステージ上にマウントされているティッシュで皿を置きます。甲介上の記録位置を顕微鏡下で中央になるようにステージの位置を合わせます。 </li><li>鼻甲介の表面に加湿空気を供給する空気タンクをオンにします。位置が離れて記録位置から約10mmになるよう空気供給管を。流速は、約600 mL /分です。 </li><li>ローパス1kHzでフィルター、および100XのゲインとDCモード（ACの増幅は、EOG信号にアーティファクトを誘発する）にアンプを設定します。 </li><li>マイクロマニピュレータの記録と参照電極をマウントします。 </li><li>取り付け皿にウェルに参照電極を下げて、それが電気的に組織に接続されるように変更されたリンゲル液で覆う。 </li><li>鼻甲介第IIbまたはIIIの表面に記録電極を慎重に下ろします。電極は、かろうじて嗅上皮の表面に触れてください！電極は、上皮（すなわち、電気回路を完了する）直線のベースラインとの接触時にオシロスコープに表示されます。 </li><li>空気供給管のサイドポートへの嗅覚ボトルを取り付けます。 </li><li>コンピュータ上で、刺激のプロトコルを開始する。データ取得のためのサンプリングレートは、2 kHz以上でなければなりません。ソフトウェアは、臭気のパルスをトリガし、録音を開始します。 </li><li>典型的な刺激プロトコルは100ミリ秒のパルスが1秒間隔で区切られたペアの100ミリ秒持続時間単パルス、または10秒の持続性の脈があります。 </li><li>組織が最小限に適応されるように、プロトコル間のいくつかの時間を許可します。 1分、最大10 -3 Mの酢酸アミルとheptaldehydeの液体の濃度で十分です。高濃度で5分の時間を要します。高い臭気濃度を配信したあとで（そのような用量 - 反応曲線の終了時など）残留臭気は、チューブ内に残る可能性があります。追加の組織サンプルを続行する前に、95％エタノールとドライでエアチューブを洗浄してください。 </li><li> Axographソフトウェアは、EOG信号の主要パラメータを測定するためのツールが用意されています。このようなパラメータは、応答の振幅、遅延時間、ピークまでの時間、および終了の時定数が含まれています。それはデジタルでさらに分析する前に、25 Hzでトレースをフィルタ処理することが望ましい場合があります。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。分析をEOGためのパラメータ。EOGのいくつかのパラメータは、マウスとの間の応答の比較のために特に有用である、応答の振幅、遅延時間（刺激を投与し、応答が開始されるまでの時間）を含めて、立ち上がり時間（開始までの時間レスポンスとピークの）、ピークまでの時間（刺激開始から応答のピークまでの時間）、および終了の時定数（τ、シングル指数方程式に応答の減衰をフィッティングによって決定）。このような待ち時間、立ち上がり時間、および終了の時定数などの動特性パラメータの比較については、それは分析前に応答のピーク振幅を正規化することをお勧めします。 <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。異なる刺激プロトコルの下で代表的なEOG信号。（）マウスからEOGsの例として酢酸アミル濃度の増加による刺激への返信です。パネルの上部にある黒い線は、嗅覚刺激のタイミングと期間を示している。伝説中の濃度は、液体溶液の濃度です。 （b）の用量 - 反応関係は、5匹の平均値。エラーバーは95％の信頼区間です。ピーク振幅の減少は、しばしば非常に高い臭気濃度で観察される。 （C）ペア - パルス刺激に対する応答のEOGの例を。臭気物質の単一の短いパルスは、数秒のための永続的な適応を誘発する。 （d）は10秒に対応してEOGの例では、嗅覚刺激を持続。 EOGは、連続的な匂いのプレゼンテーション中に脱感作を示しています。

<ol><li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).</li>
<li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroolfactogram%3A+a+review+of+its+history+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
<li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+in+G%28olf%29+are+anosmic%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li>
<li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li>
<li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2%2B-calmodulin-dependent+odor+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li>
<li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li>
<li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+marker+protein+%28OMP%29+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li>
<li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li>
<li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2%2B%2FCaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li>
<li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%22IP%283%29-odors%22%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li>
<li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li>
<li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li>
<li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li>
</ol>

マウスは、ジョンズホプキンス大学の動物実験委員会により認可された方法で処理し、安楽死させた。

このプロトコルで説明されている設定で、嗅上皮の表面の匂い刺激は、正確な匂いの濃度とダイナミクスが未知であっても、野生型と変異型マウス間の比較を可能にする、組織の準備の間に一貫性があります。いくつかの要因が、特に録音の場所と加湿空気の流量は、EOGの変動を引き起こす。ケアは、ばらつきを最小限に抑えるために、同じ鼻甲介上に同じような位置から録音に注意する必要があります。これは、簡単に一貫して頭部の同じ側から録音すると、顕微鏡、臭気デリバリーチューブ、および組織サンプルの間に変更されていないエアテーブル上でマニピュレーターのフットプリントを保つことによって達成することができます。さらに、組織サンプルをすぐに組織の過度の乾燥を防ぐために、解剖後に加湿空気流中に配置する必要があります。 マウスでEOG記録は、7、14、15、またはヘッドには手をつけずと甲16、17を超えるドリル小さな穴に電極を挿入してを甲準備マウスで液体灌流装置を用いて実施することができます。 EOG記録の各バリエーションには、独自の強みを持っています：組織標本上で空気相の記録をこのプロトコルで説明するようにセットアップの最小限の量を必要とし、実施するのが最も簡単です。液体灌流装置を使用しての録音は、薬理学的試薬の使用を促進する、ものの多くの匂い物質の疎水性の性質は、臭気の配信を複雑にし、最後に、ヘッドはそのまま残っているこれで録音は&quot;人工的なにおいを嗅ぐ&quot;の実験で使用することができる、電極配置は、甲が完全に露出しているときよりも難しいですが。

<table><tbody><tr><td>空気供給チューブ</td><td>装置・器具</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>T字フィッティングを装着した1 mLシリンジのシリンダーを代用品として使用できます。</td></tr><tr><td>エアテーブル</td><td>装置・機器</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>アンプリファイアー</td><td>装置・器具</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータおよびデータ収集ソフトウェア</td><td>装置・器具</td><td>Apple Macintosh上のAxograph 4.9.2</td><td></td><td>Mac OS XおよびWindows向けに更新されたバージョンのAxographが、http://axographx.com/ から入手可能です。</td></tr><tr><td>ブタン torches</td><td>装置・器具</td><td></td><td></td><td>A cr&amp;#232;me br&amp;#251;申し訳ございませんが、翻訳対象となるソーステキストが入力されておりません。翻訳する英文をご提示ください。&amp;#232;トーチは正常に機能します。</td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>装置・器具</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>装置・器具</td><td>サイエンスコープ</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>装置・器具</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>磁気保持デバイス (12 mm)</td><td>装置・器具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>装置・器具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>装置・器具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>装置・器具</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>装置・器具</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>機器</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>試料ステージ</td><td>装置・器具</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>マウンティングディッシュの高さを上げるために、任意の小さな固形物を使用できます。モデリングクレイを用いてディッシュを固定してください。</td></tr><tr><td>18ゲージ針</td><td>材料</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>2オンス ガラス瓶</td><td>材料</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>材料</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>シリコンストッパー サイズ16D</td><td>材料</td><td>化学器具</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>銀線</td><td>材料</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>材料</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>World Precision Instruments社製</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アミル</td><td>試薬</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタールデヒド</td><td>試薬</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2·6H2O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6時間&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>試薬</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>流量計</td><td>器具・装置</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

空気相electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

動物はそのような、食料源を見つけるの捕食者を回避し、交配やその他の社会的相互作用のための同種を識別するなど、多くの重要な行動のための嗅覚に依存しています。 electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでのアッセイ嗅覚機能への、有益な実施が容易、かつ信頼性の高い方法です。カエル1のOttosonによるEOG 1956年の記述以来、EOG記録はサンショウウオ、ウサギ、ラット、マウス、およびヒト（スコットとスコットジョンソン、2002、refによってレビューさ2）を含む多くの脊椎動物に適用されています。マウスの遺伝子改変の最近の進歩は、ノックアウトとマウス、ノックの嗅覚機能の生理学的特性評価のためのEOGを記録に関心を再燃している。 EOG録音が正常嗅覚シグナル伝達コンポーネント3-8の中心的役割を示すために、そしてより最近では9月12日 OSNの応答に特定の調節機構の寄与を特徴づけるために適用されている。 匂いの検出は、繊毛に流入し、膜13の脱分極電流を発生、シグナル伝達カスケードは、イオンチャネルの開口につながるOSNs、の繊毛で嗅上皮の表面で発生します。 EOGは、記録のフィールド2内の個々の応答OSNsによって引き起こされる潜在的な変化の和から、その結果、匂い刺激により嗅上皮の表面で細胞外に記録された負電位である。 EOGの振幅と速度の比較は、このように遺伝子改変および他の実験操作は、臭気にOSN応答の根底にある分子のシグナル伝達をどのように影響するかについての貴重な情報を提供しています。 ここでは、マウス嗅覚甲介の準備の空気相のEOGの録音について説明します。簡単に言えば、マウスを犠牲にした後、嗅覚甲介が正中線に沿って頭を二等分し、中隔を除去することによって公開されています。鼻甲介の準備をして、録音の設定で配置され、及び記録電極は内側甲介のいずれかで嗅上皮の表面に配置されます。参照電極は、電気的に緩衝溶液を介して組織に接続されています。加湿空気の連続的な流れは、それが湿った保つために上皮の表面に吹き付けられる。匂いのソリューションの蒸気は、上皮を刺激する加湿空気​​の流れに吹きましたれる。応答が記録され、さらなる分析のためにデジタル化されています。

electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでの嗅覚機能を評価するための有益な、簡単に行動し、信頼性の高い方法です。このプロトコルは、録音の設定、マウスの組織の準備、データ収集、および基本的なデータ解析を説明します。

空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

動物は、餌場の探索、捕食者の回避、そして交配のための同種の個体の識別など、多くの重要な行動を嗅覚に依存しています。

嗅上皮の標本をディッシュに固定し、加湿空気の流れの中に置きます。解剖顕微鏡下で、緩衝液を介して参照電極を組織に電気的に接続します。次に、記録電極を嗅上皮の表面に配置します。コンピュータ制御によるにおい物質のパフを加湿空気流に載せて投与し、嗅上皮を刺激します。この空気流によってにおい物質が嗅上皮へと運ばれます。EOG信号はアンプとデジタイザーを介して記録用コンピュータに送信されます。こんにちは、ジョンズ・ホプキンス大学生物学部のLaboratory of Hygiene XOのCatherine Ciarです。本日は、マウスから電気嗅覚図（electro-olfactogram）を記録する手順をご紹介します。当研究室では、臭気に対する嗅覚感覚ニューロンの反応を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めましょう。記録装置は、記録電極、参照電極、空気供給管、試料ステージ、および解剖顕微鏡で構成され、これらはすべてファラデーケージ内のエアテーブルに固定されています。電極を空気供給管内に配置するために、マイクロマニピュレーターが使用されます。連続的な気流を蒸留水の中にバブリングさせて加湿し、その後、空気供給管を通って試料の上に送ります。標本の固定面として、厚さ6〜8 mmのガードで調整された60 mm培養皿を使用します。固定皿内のガードには、ウェルとチャネルが形成されています。これは、修正リンゲル液を介して参照電極を標本に電気的に接続するための手段を提供するためです。記録電極と参照電極をアンプに接続します。アンプからの信号はデジタイザに送られ、その後コンピュータに転送されます。刺激プロトコルの制御、信号の記録、および応答の解析には、XI graphソフトウェアを使用します。記録電極の設置時およびEOG記録中の電位をリアルタイムでモニタリングするため、増幅器の後段にオシロスコープを接続します。嗅覚刺激の提示はピコスプリッツァーで制御し、この装置は信号収集に使用しているコンピュータと同じコンピュータに接続されており、刺激提示の直前に制御されます。ピコスプリッツァーの出力を、液状の臭気物質が入った臭気ボトルに接続します。次に、ボトルを空気供給チューブに接続します。それでは、記録実験のための電極の準備方法について見ていきましょう。記録電極は、修飾リンゲル液を満たした引き伸ばしガラスキャピラリーに入った塩化銀線である。参照電極は塩化銀線である。電極ホルダーに銀線を装着し、両電極の準備を開始する。記録電極については、電極ホルダーの端から1〜2 cmのワイヤーを突き出させます。参照電極の場合は、より長いワイヤーを残しても構いません。塩化銀コーティングを施すには、ワイヤーを0.1 molar 塩化ナトリウム溶液に浸し、電極ホルダーを1.5〜9 Vの直流電源の正極に接続します。電源の負極を0.1 molar 塩化ナトリウム溶液に電気的に接続します。記録電極と参照電極の間の静電電荷を等しくするため、塩素反応を10分間進行させます。電極を記録装置に取り付ける前に、電極同士を軽く接触させてください。次に、マイクロピペットプラーを用いてガラスキャピラリーを延伸します。キャピラリー先端の開口径は5〜10 µm程度にしてください。ダイヤモンドペンシルでキャピラリーの鈍端に傷をつけ、銀線よりも約2 cm長くなるように切り離します。ブタン torches を使用して切断端を火炎研磨し、0.5% agros を含んだ修正リンガー液を溶解させます。加熱して細長く引き延ばしたシリンジを用い、転送ピペットで溶融した agro solution を少量、電極の先端に引き込みます。引き延ばしたキャピラリーの約半分まで充填してください。修正リンガー液を用いて、キャピラリーを軽く弾き、気泡を取り除きます。充填した電極は、底部に少量の修正リンガー液を入れた保存瓶に、使用直前まで保管してください。組織サンプルの準備が整い、記録が可能な状態になったら、充填済みのキャピラリーを記録電極線に取り付け、電極を準備します。記録のための組織調製を行う記録実験について見ていきましょう。犠牲にしたマウスの頭蓋骨上の皮膚を除去し、頭部を正中線に沿って等分に二分します。頭部の半分を内側が上になるように固定皿に固定してください。その後、鼻甲介を露出させるために、鼻中隔を慎重に除去します。組織を固定したディッシュを記録ステージに置きます。顕微鏡の下に比甲介骨の記録部位が中心にくるようにステージを調整します。次に、エアタンクのバルブを開き、比甲介骨の表面に毎分約600 millilitersの加湿空気を供給します。空気供給チューブを、記録位置から約 10 millimeters 離れた場所に配置します。AC増幅はEOG信号にアーティファクトを誘発するため、アンプをDCモードに設定してください。ローパスフィルターを 1 kilohertz、ゲインを 100 x に設定して記録します。次に、記録電極と参照電極をマイクロマニピュレーターに取り付けます。参照電極をマウンティングディッシュのウェル内に下げ、組織と電気的に接続されるように修正リンガー液で満たします。記録電極を、比甲介鼻甲介2Bまたは3の表面に慎重に降ろします。電極が嗅上皮の表面にわずかに触れるようにしてください。電極が上皮に接触すると、オシロスコープに直線的なベースラインが表示されます。次に、コンピュータに接続された空気供給チューブのサイドポートに、臭気物質のボトルを取り付けます。刺激プロトコルを開始します。データ収集のサンプリングレートは2 kHz以上に設定してください。ソフトウェアが臭気パルスをトリガーし、記録を開始します。一般的な刺激プロトコルとしては、持続時間100ミリ秒のシングルパルス対、1秒の間隔を空けた100ミリ秒のパルス、または10秒間の持続パルスなどが挙げられます。順応を最小限に抑えるため、高濃度の臭気を提示した後は、プロトコル間に1分から5分の間隔を設けてください。チューブ内に臭気が残留する場合があるため、追加の組織サンプルに進む前に、エアチューブを95%ethanolで洗浄し、乾燥させてください。Axo graftソフトウェアは、EOG信号の主要なパラメータを測定するためのツールを提供します。これらのパラメータには、応答振幅、潜時、ピーク到達時間、および終結時定数が含まれます。EOGのいくつかのパラメータ、特に応答振幅、潜時上昇時間、ピーク到達時間、および終結時定数は、マウス間での正規化された応答を比較する際に特に有用です。ここでは、濃度の異なる液体酢酸アミル刺激に対するマウスのOGを示しています。上部の黒線は、臭気刺激のタイミングと持続時間を示しています。ここでは、マウス5匹の平均による用量反応関係が示されており、エラーバーは95%信頼区間を表しています。非常に高い臭気濃度では、ピーク振幅の低下がしばしば観察されます。対ペアパルス刺激に対するEOGの例が示されており、単一の短時間の臭気パルスによって数秒間持続する適応が誘発されます。ここでは、10秒間の持続的な臭気刺激に対するEOGを示しています。EOGでは、臭気物質の連続提示中に脱感作が起こることが示されます。ここでは、マウスから電極ファクトグラムを記録する方法を説明しました。この手順を行う際は、電極を上皮の表面にのみ配置し、表面下に突き刺さないようにすることが重要です。ばらつきを最小限に抑えるため、常に頭部の同じ側から記録を行い、セットアップの変更を避けてください。組織は湿潤状態に保ちますが、液滴が溜まらないようにしてください。解剖後すぐに組織を加湿空気下に置くことで、記録に最適な状態で組織を維持できます。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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