ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

MSCと略称される間葉系幹細胞を、6〜8週齢のRag-dolly雌ラットから単離し、約80%のコンフルエンシーに達するまで10 cmのペトリ皿で培養します。MSCを濃縮するため、細胞をビオチン標識一次抗体で染色し、続いてストレプトアビジン標識磁気ビーズを反応させます。その後、磁気活性化細胞分取法（MACS）により、標識された細胞をネガティブ分画とポジティブ分画の2つの分画に分離します。

続いて、フローサイトメトリー解析を用いて表面マーカーの発現を確認します。最後に、クローニングシリンダーを使用して、単一コロニー由来のMSCを取得します。こんにちは、ミシガン州立大学化学工学・材料科学科のChristina Chang研究室のLeeです。

本日は、chy幹細胞の単離と濃縮、および単一コロニー由来細胞の取得手順について解説します。当研究室では、この手順を用いて赤色幹細胞の増殖および分化挙動を研究しています。それでは、始めていきましょう。

6〜8週齢の雌のSprague-Dawleyラットから間葉系幹細胞（MSC）を単離します。まず、安楽死させた動物の後肢から大腿骨と脛骨を切り出します。皮膚と筋肉を取り除き、切り出した大腿骨と脛骨を70%イソプロパノールに数秒間浸した後、1X DPBSに移します。

以下の手順はバイオセーフティキャビネット内で行ってください。まず、大腿骨と脛骨をDMEMを含む10 centimeterのディッシュに移します。次に、各骨をピンセットで固定しながら、両端をハサミで切り開きます。

22ゲージの針を3 mLシリンジに取り付け、DMEMを満たします。骨の開口端に針を挿入し、骨髄を50 mLチューブにフラッシュします。すべての骨髄を回収するまで、各骨に対してこの操作を2〜3回繰り返します。

細胞を再懸濁し、70 µmのセルストレーナーに通して骨の破片や血液凝集物を取り除きます。4 °Cで200 ×g、5分間遠心分離します。吸引して上清を除去した後、25 mLのMSC medium seedに細胞を再懸濁します。

10 mLの細胞懸濁液を2枚の10 cm培養皿にそれぞれ分注します。培養皿を37 °C、5% CO2インキュベーター内で1〜2週間培養します。あらかじめ単離したラットMSCが約80%のコンフルエンシーに達したら、培地を吸引し、各皿に4〜5 mLのtrypsin EDTAを加えます。

ディッシュをインキュベーターに戻し、約5分間インキュベートします。細胞を剥離させるため、等量の培地を加えてトリプシンを不活性化します。細胞懸濁液を15 mLチューブに回収し、4 °C、200 ×gで5分間遠心分離して細胞を沈殿させます。

次に、2つの表面マーカーであるCD 54とCD 90を用いてMSCを濃縮する方法を実演します。BD Biosciences社の細胞分離用マグネットであるBD I magnetを使用します。まず、細胞ペレットを細胞染色バッファーに懸濁し、細胞密度を20 million cells/mLに調整します。

次に、ビオチン化CD 54抗体およびビオチン化CD 90抗体を細胞懸濁液に添加し、緩やかに混合します。氷上で15分間インキュベートした後、1X BD IMAGバッファーを十分な量加えてラベル化した細胞を洗浄します。ラベル化した細胞を200 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。BD imagストレプトアビジン粒子を十分にボルテックスして調製し、細胞10 million個につき粒子を40 µL添加します。

粒子と標識細胞を十分に混ぜ合わせ、6～12 °Cで30分間インキュベートします。このインキュベーション時間中に、陽性分画を回収するための丸底試験管にラベルを貼ります。インキュベーション終了後、標識液の量を1 mLあたり2,000万細胞に調整します。

1回分のExpedia I magバッファーを用いて、標識した細胞を陽性画分回収チューブに移します。陽性画分チューブをBDIマグネットの上に置き、6分間静置します。

次に、陽性分画チューブをBDIマグネットに載せたまま、ガラスパステールピペットで上清を除去します。続いて、陽性分画チューブをBDIマグネットから取り外し、氷上に置きます。1 mLの氷冷した1x BDI mag bufferを加え、穏やかに混合して細胞を再懸濁します。

チューブをBDIマグネットに戻し、2〜4分間静置します。新しいガラス製パステールピペットを用いて上清を除去します。前述の手順に従い、洗浄を繰り返します。

もう一度繰り返します。最後に、新しいガラスパステールピペットで上清を除去します。その後、BDIマグネットラックからチューブを取り出します。

細胞を1 mLの培地で懸濁し、25 mLのシード培地を含む50 mLチューブに細胞懸濁液を移します。細胞の維持には175 cm²のスクエアフラスコを、フローサイトメトリーには10 cmディッシュを使用します。

単一コロニー由来のMSCを分離する手順を開始するために、10 cmディッシュあたり約50～100個の細胞を播種し、37 °C、5% CO₂インキュベーターで1～2週間培養します。この1～2週間の期間中に、倒立顕微鏡を用いて十分に独立したコロニーを確認します。各コロニーが100個以上の細胞を含む十分な大きさに達したら、ディッシュの底面に油性マーカーでコロニーに印を付けます。

マーキングするコロニーを選択する際は、周囲に他のコロニーがないことを確認してください。培地を吸引し、ピンセットを用いて1×DPBSでディッシュを1回洗浄します。滅菌済みのクローニングシリンダーを取り、マーキングしたコロニーの周囲にそっと配置します。

すべてのマークされたコロニーにクローニングシリンダーが配置されるまで、この操作を繰り返します。各クローニングシリンダーに 100 µL の tripsin EDTA を加え、ディッシュをインキュベーターに戻します。5分後、顕微鏡下で細胞が丸くなっているかを確認します。

細胞が剥離したら、トリプシンを不活化させるために同量の培地を加えてください。200 µL マイクロピペッターで細胞懸濁液を混ぜ合わせ、あらかじめ温めておいた 3 mL の培地が入った 60 mm ディッシュに細胞懸濁液を移します。ディッシュにラベルを貼り、プラスチック接着性の細胞を単離した後、再びインキュベーターに戻します。

MSCは播種した翌日に観察できるはずです。細胞は増殖し続けます。コンフルエントになった細胞は、この位相差顕微鏡像に示されているように、大部分が紡錘形または星形に見える必要があります。細胞が約80%のコンフルエンスに達したときが、適切な培養タイミングとなります。

トリプシン処理後、剥離した細胞は円形で培地中に浮遊しているはずです。磁気細胞分取によってMSCを濃縮した後、表面マーカーの発現を確認するためにフローサイトメトリーを行います。濃縮が適切であれば、細胞はMSCマーカーであるCD 54およびCD 90に対して陽性反応を示し、HSCマーカーであるCD 45に対しては陰性反応を示すはずです。陰性コントロールとしては、アイソタイプコントロールのIgG two AおよびIgG oneを使用します。

細胞が適切なクローナル密度で播種されている場合、この例に示すように、単一の細胞からコロニーが形成されます。その後、クローニングシリンダーを用いてコロニーを分離し、得られた細胞を個別に培養することができます。これら2つの例では、一方のコロニー由来の細胞は紡錘形であるのに対し、もう一方のコロニー由来の細胞は円形です。

以上で、ランダムおよび一般的な幹細胞の分離・濃縮方法、ならびに単一コロニー由来細胞の取得方法について説明しました。この手順において、分離時に血凝固塊や骨の破片を取り除くことが重要である点に留意してください。濃縮の際は抗体を最適量使用し、コロニー分離の際は十分に分離されたコロニーに明確に印を付けてください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を祈っております。