ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

間葉系幹細胞（MSCsと略記）を、6〜8週齢のRag Dolly雌ラットから単離し、約80%のコンフルエンスに達するまで10 cmペトリ皿で培養します。MSCを濃縮するため、細胞をビオチン標識一次抗体で染色し、続いてストレプトアビジン標識磁気ビーズで染色します。その後、磁気活性化細胞分取法（MACS）により、標識された細胞を陰性分画と陽性分画の2つの分画に分離します。

続いて、フローサイトメトリー解析を用いて表面マーカーの発現を確認します。最後に、クローニングシリンダーを用いて単一コロニー由来のMSCを取得します。こんにちは、ミシガン州立大学化学工学・材料科学科のChristina Chang研究室のLeeです。

本日は、chy幹細胞の単離および濃縮、ならびにシングルコロニー由来細胞の取得手順について解説します。当研究室では、赤色幹細胞の増殖および分化挙動を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。

間葉系幹細胞（MSC）を、生後6〜8週の雌のSprague Dawleyラットから単離します。まず、安楽死させた動物の後肢から大腿骨と脛骨を切除します。皮膚と筋肉を取り除き、切除した大腿骨と脛骨を70%イソプロパノールに数秒間浸した後、1 X DPBSに移します。

以下の手順はバイオセーフティキャビネット内で行ってください。まず、大腿骨と脛骨をDMEMを含む10 centimeterのディッシュに移します。次に、ピンセットで各骨を固定しながら、両端をハサミで切開します。

22ゲージの針を3 mLシリンジに取り付け、DMEMを満たします。骨の開いた端の一方に針を挿入し、骨髄を50 mLチューブへ洗い出します。すべての骨髄が得られるまで、各骨に対してこの操作を2〜3回繰り返します。

細胞を再懸濁し、70 µmのセルストレーナーに通過させて骨片や血液凝集塊を除去します。4 °Cで200 ×g、5分間遠心分離します。吸引により上澄みを除去した後、25 mLのMSC medium seedで細胞を再懸濁します。

10 mLの細胞懸濁液を、2枚の10 cm培養皿にそれぞれ分注します。これらの培養皿を37 °C、5% CO₂インキュベーター内で1〜2週間培養します。 previously isolated rat MSCsが約80%のコンフルエンスに達したら、培地を吸引し、各皿に4〜5 mLのtrypsin EDTAを加えます。

ディッシュをインキュベーターに戻し、約5分間インキュベートします。細胞を遊離させるため、等量の培地を加えてトリプシンを不活化します。細胞懸濁液を15 mLチューブに回収し、4 °C、200 ×gで5分間遠心分離します。

それでは、2つの表面マーカーであるCD 54およびCD 90を用いて、MSCを濃縮する方法を実演します。BD Biosciences社の細胞分離用マグネットであるBD I magnetを使用します。まず、細胞ペレットを細胞染色バッファーに再懸濁し、細胞濃度を20 million cells/mLに調整します。

次に、ビオチン化CD 54抗体およびビオチン化CD 90抗体を細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合します。氷上で15分間インキュベートした後、1X BD IMAGバッファーを十分な量加えて、標識した細胞を洗浄します。標識した細胞を200 ×g、4°Cで5分間遠心分離します。BD imagストレプトアビジン粒子を十分にボルテックスして調製し、細胞10 million個につき40 µLの粒子を添加します。

粒子と標識細胞を十分に混合し、6〜12°Cで30分間インキュベートします。このインキュベーションの時間に、陽性画分を回収するためのラウンドボトム試験管にラベルを貼ります。インキュベーション終了後、標識体積を1 mLあたり2,000万細胞に調整します。

1回分（1 mL）のExpedia I 磁気バッファーを用いて、標識した細胞を陽性分画回収チューブに転送します。陽性分画チューブをBDIマグネットの上に置き、6分間静置します。

次に、陽性分画チューブをBDIマグネットに載せたまま、ガラスパステールピペットで上清を除去します。続いて、陽性分画チューブをBDIマグネットから取り出し、氷上に置きます。1 mLの氷冷した1×BDI mag bufferを加え、穏やかに混ぜて細胞を再懸濁させます。

チューブをBDIマグネットに戻し、2〜4分間そのままにします。新しいガラスパステアピペットを用いて上清を除去します。前述の手順に従い、洗浄を繰り返します。

もう一度繰り返します。最後に、新しいガラス製パスツールピペットで上澄み液を除去します。その後、BDIマグネットラックからチューブを取り出します。

細胞を1 mLの培地で懸濁し、25 mLの播種用培地を含む50 mLチューブに細胞懸濁液を移します。細胞の維持には175 cm²のスクエアフラスコを、フローサイトメトリーには10 cmディッシュを使用します。

単一コロニー由来のMSCを分離する手順を開始するには、10 cmディッシュあたり約50〜100個の細胞を播種し、37 °C、5% CO2インキュベーターで1〜2週間培養します。この1〜2週間の期間に、倒立顕微鏡を用いて十分に孤立したコロニーを確認します。各コロニーが100個以上の細胞を含む十分な大きさに達したら、ディッシュの底面に油性マジックでコロニーをマークします。

マーキングするコロニーを選択する際は、周囲に他のコロニーがないことを確認してください。培地を吸引し、ピンセットを用いて1回のX-D-P-B-Sでディッシュを洗浄します。滅菌済みのクローニングシリンダーを手に取り、マーキングしたコロニーの周囲に静かに配置します。

すべてのマークされたコロニーにクローニングシリンダーが配置されるまで、この操作を繰り返します。各クローニングシリンダーに100 µLのtrypsin EDTAを加え、ディッシュをインキュベーターに戻します。5分後、顕微鏡で細胞を確認し、細胞が丸くなっているかを確認します。

細胞が剥離したら、等量の培地を加えてトリプシンを不活性化します。200 µL マイクロピペッターで細胞懸濁液を混合し、3 mL の予熱済み培地を含む 60 mm ディッシュに細胞懸濁液を移します。ディッシュにラベルを貼り、プラスチック接着性の細胞を単離した後、再びインキュベーターに戻します。

播種した翌日には MSCs が確認できるはずです。細胞が増殖し続けるにつれて、コンフルエントになった細胞は、この位相差像に示されているように、大部分が紡錘形または星形に見えます。細胞が約 80% のコンフルエンスに達したときに継代を行うのが適切です。

トリプシン処理後、遊離した細胞は円形になり、培地中に浮遊している必要があります。磁気細胞分取によってMSCを濃縮した後、表面マーカーの発現を確認するためにフローサイトメトリーを行います。濃縮が適切であれば、細胞はMSCマーカーであるCD 54およびCD 90に対して陽性反応を示し、HSCマーカーであるCD 45に対しては陰性反応を示します。陰性対照としては、アイソタイプコントロールのIgG two AおよびIgG oneが使用されます。

細胞が適切なクローナル密度で播種されている場合、この例に示すように、単一の細胞からコロニーが形成されます。その後、クローニングシリンダーを使用してコロニーを分離し、そのコロニー由来の細胞を個別に培養することができます。これら2つの例では、一方のコロニー由来の細胞は紡錘形をしており、もう一方のコロニー由来の細胞は円形をしています。

以上で、ランダムおよび共通の幹細胞の単離と濃縮方法、ならびに単一コロニー由来細胞の取得方法について説明しました。この手順において重要な点は、単離時に血液凝固物や骨の破片を除去することです。濃縮時には最適な量の抗体を使用し、コロニー分離時には十分に単離されたコロニーに明確に印を付けてください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功を願っております。