メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス

以下のプロトコルでは、メチル栄養要求性酵母を用いたタンパク質発現について説明します。まず、電撃用コンピテント酵母細胞の調製と、目的遺伝子を含むベクターのPichia pastorisへの導入を示し、続いて目的遺伝子が酵母ゲノムに正しく組み込まれたかを確認するための酵母DNA精製ステップを行います。最後に、組換えタンパク質の発現を実施します。

こんにちは。ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部、Steven Hallam研究室のMariaです。Helm研究室のMarcusです。本日は、酵母Pichia pastorisにおいて組換えタンパク質を発現させる手順をご紹介します。

当研究室では、環境DNAが抽出・保存されており、メタゲノムライブラリーが構築されている未培養微生物のタンパク質を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。メチル栄養酵母であるP. pastorisにおいて組換えタンパク質を発現させるには、目的遺伝子をP. pastoris用ベクターにインフレームでクローニングする必要があります。

本実験では、ベクターPPIC Z alpha Aを使用します。このベクターには、目的遺伝子のメタノール誘導発現を厳密に制御するためのAO X oneプロモーター、組換えタンパク質を分泌させるためのα因子分泌シグナル、E. coliおよびPichiaの両方で選択するためのzea resistance遺伝子、そして組換えタンパク質の検出および精製のためのc-mycエピトープとポリヒスチジンタグを含むC末端ペプチドが含まれています。形質転換を行う前に、制限酵素消化により目的遺伝子を含むベクターを線状化します。ここではPME 1酵素を使用しますが、インサートにその制限部位が含まれていない限り、他の制限部位も使用可能です。

十分な量の線状化ベクターDNAを得るために、3〜4本の個別のチューブで50 µLの制限酵素消化反応を行い、消化後、すべての溶液を合わせてコンストラクトを濃縮します。AmCon遠心フィルターユニットおよびMicroCon遠心フィルターユニットを用い、PPA dousへの形質導入には、滅菌水5〜10 µLに溶解した5〜20 µgの線状化DNAが必要となります。電撃法用コンピテントPPA dousを準備するには、予定している形質導入の4日前に、SNを含まないAYPDSプレートに細胞をストリークし、30 °Cで1〜2日間、または形質導入の2日前までに単一コロニーが形成されるまで培養します。

50 mLのFalconチューブを用い、PPAまたは菌株を5 mLのYPD培地で30 °Cにて一晩培養します。形質転換の前日に、シェーカーに固定するためFalconチューブをフラスコに入れます。一晩培養した培養液0.25 mLを用い、2 Lフラスコに入れた500 mLの新鮮なYPD培地に接種します。

シェーカーを用いて30 °Cで一晩さらに培養し、OD 600を1.3から1.5まで高めます。形質転換の当日は、氷、冷やした滅菌水、および1 Mのソルビトールを用意しておきます。細胞を4 °Cで1500 Gs、5分間遠心分離します。

遠心分離後、ペレットを500 millilitersの氷冷した滅菌水で懸濁します。遠心管の容量に応じて、分量を2本のチューブに分けるか、複数回に分けて操作を行う必要があります。細胞を再度遠心分離し、ペレットを250 millilitersの氷冷した滅菌水で再懸濁します。

遠心管の容量に応じて、個別の細胞ペレットを1本のチューブにまとめることができます。再度遠心分離を行った後、ペレットを再懸濁させます。氷冷した1 M sorbitol 20 mLで再懸濁した細胞を50 mLファルコンチューブに移し、遠心分離を行います。

最終遠心後、ペレットを1 mLの氷冷1 M sorbitolで再懸濁し、最終容量を約1.5 mLにします。マイクロ遠心チューブに再懸濁した細胞を入れ、形質転換に使用するまで氷上または4 °Cで保存します。濃縮した直鎖状コンストラクトをPPAストレージ細胞に形質転換させる前に、以下の試薬および器具を準備します。

マイクロ遠心チューブに1 Mのソルビトールを1 mL入れ、氷上に置きます。0.2 cmのエレクトロポレーションキュベットを氷上に置きます。

滅菌済みの15 milliliterガラスチューブにラベルを貼り、ピペット用の滅菌済みガラスペーストを用意します。あらかじめ調製しておいたエレクトロコンピテントセル 80 microlitersを、氷冷した0.2 centimeterエレクトロポレーションキュベットに移します。

プラスミドDNA溶液を細胞に添加し、ピペットチップを左右に動かして混合します。エレクトロポレーションキュベットに入れ、細胞が入ったキュベットを氷上で5分間インキュベートします。

次に、ティッシュでキュベットの外側を拭き取り、使用しているエレクトロポレーション装置のメーカーが推奨する出芽酵母用のパラメータに従って、細胞にパルスを与えます。このデモンストレーションでは、BioRad gene Pulserを以下の条件で使用しています。充電電圧1500 volts、静電容量25 micro ferres、パルス直後の抵抗200 ohmsです。

氷冷した1 M sorbitolを1 mL、チューブに加えます。滅菌済みのガラス製パステールピペットを使用して、チューブの内容物を滅菌済みの15 mLチューブに移します。このチューブを30 °Cで、振盪せずに1.5時間インキュベートします。

1.5時間後、エレクトロポレーション後の細胞をプレートに播種できる状態になります。Zainを100 micrograms per milliliter含有する、ラベル付けされた4枚のYPTSプレートそれぞれに、滅菌済みのガラスビーズを5個から10個加えます。エレクトロポレーション液250 microlitersを広げます。

各プレート内で混合し、プレートを水平に揺らして細胞を均一に分散させます。プレートを15分間乾燥させた後、プレートを反転させてアガロからビーズを取り除きます。光に敏感なZainの分解を防ぐため、プレートを黒色プラスチックで包み、コロニーが形成されるまで30 °Cで2〜3日間、プレートを逆さまにしてインキュベートします。

12個のコロニーを選択します。100 µg/mLのゼインを含む新鮮なYPDSプレートにクローンをストリークして、それらを精製します。タンパク質発現用のPPA細胞を調製するため、精製したピキアコロニーから単一コロニーを選択し、滅菌済みの250 mLフラスコに入れた25 mLのVMGY培地に接種し、OD 600が2から6に達するまで振盪インキュベーターを用いて30 °Cで培養します。

細胞が適切なOD 600に達したら、保存用の細胞グリセロールストックを調製します。2 mLの凍結保存バイアルに800 µLの細胞培養液を移し、200 µLの滅菌済みグリセロールを加えます。このグリセロールストックを-80 °Cで保存します。

さらに、細胞培養液1.5 millilitersをマイクロ遠心チューブに移します。室温で1300 GSで1分間遠心分離し、細胞を回収します。ペレットを4°Cで保存します。

これらの細胞は、目的遺伝子がpichiaゲノムに組み込まれたことを確認するため、インサート特異的プライマーを用いたPCR後のpichiaストランドをアガロースゲルで分析するための酵母DNA精製に使用します。残りの25 milliliterの培養液を50 milliliterのFalconチューブに移し、室温で3000 Gsで5分間遠心分離して細胞を回収します。上澄みをデカントし、チューブをティッシュの上に逆さまに置いて残留メディアを除去します。細胞ペレットを洗浄するため、20 millilitersのBMMY培地中でボルテックスまたはピペッティングにより再懸濁し、遠心分離します。

上清をデカンテーションで除去した後、細胞ペレットをボルテックスまたはピペッティングでBMMY発現誘導培地を用いて再懸濁し、OD 600を1.0に調整します。培養液を1リットルのバッフル付きフラスコに移し、フラスコを200ミリリットルのビーカーで覆います。

培養液により多くの酸素を取り込むことができるため、バッフル付きフラスコの使用を強く推奨します。メタノール誘導中に効率的なタンパク質発現を得るための培地を用い、フラスコをインキュベーターに入れ、30°Cで増殖を継続させます。インキュベーターの温度が変動する場合、温度が30°Cを超えないようにすることが重要です。

温度を28 °Cに設定します。発現開始後の特定の時点において誘導を維持するため、24時間ごとに滅菌済みの純メタノールを最終濃度0.5%methanolになるように添加します。培養液1 mLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、1300 ×gで2.5分間遠心分離します。室温で、上清を別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

上清と細胞ペレットを−80 °Cで保存し、後の解析に備えます。異なるタイムポイントのサンプルを解析し、誘導後のタンパク質発現に最適な期間を決定します。ここでは、ホストシステムとしてPIA Pastisを用い、リコンビナントタンパク質の発現に成功した代表的な結果を示します。

このウェスタンブロット画像は、発現から24時間後の4つの発現タンパク質を示しています。免疫ブロットに使用した抗体はacemic HRP抗体です。2番目のレーンは陰性対照であり、親ベクターで形質転換されたため組換えタンパク質を発現しない細胞の上清をロードしています。

真核生物ホストであるPQ.Plusを用いた組換えタンパク質の発現方法について説明しました。この手順を行う際は、目的遺伝子が正しくクローニングされ、フレームが合っていることを確認するためにコンストラクトのシーケンシングを行うこと、および開始前にすべてのプレートと試薬を準備しておくことが重要です。また、メタノール誘導によるタンパク質発現の前に、十分な数の形質転換体を得るために、十分な量の線状化プラスミドを調製しておくことも重要です。タンパク質発現を阻害する可能性のあるグリセロールの残渣を除去するため、細胞ペレットを十分に洗浄してください。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。