Name: メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学ぶ Pichia pastorisを用いた組換えタンパク質発現法。電気コンピテント細胞の調製、ベクター導入、DNA精製、Westernブロットによる検証までの完全プロトコルを解説。タンパク質機能研究に応用可能です。

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我々はこの作業を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金、及び保健研究（CIHR）のカナダの協会のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからのフェローシップでサポートされていました。

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

ホストシステムとしてメチロトローフ酵母Pichia pastorisにを使用してタンパク質発現は、このプロトコルで説明されています。タンパク質は、使用されるクローニングベクターに応じて、培地中に分泌することができます。組換えタンパク質の分泌は、その後の精製が容易になります。しかし、示した条件が増加し、タンパク質レベルで生じることが条件と発現時間の異なる蛋白質と変化の発現に最適化する必要があります。このプロトコルで使用されているベクトルは 、c - mycのエピトープの機能を持っており、このエピトープに対する抗体を購入することができます。これは、抗体がまだ利用がないとなるタンパク質の分析を行うことができます。親ベクターのHisタグ機能は、金属キレート樹脂にタンパク質の精製を容易にし、利用可能なベクトルのHisタグ部に対する抗体もあります。 このプロトコールに記載されているように、 ピキアパストリスにおけるタンパク質発現は、よく計画し、準備する必要がマルチステッププロセスです。 2〜3週間の時間がすべての手順を実行...

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

微生物、真核宿主ピキアパストリスのタンパク質発現は、高速で使いやすい発現系で組換えタンパク質を大量に生成する可能性を提供しています。 単細胞微生物P.としてピキアパストリスは、操作が容易であり、高い細胞密度で安価なメディアに急速に成長する。真核生物、P.ビーイングピキアパストリスは、高等真核細胞および得られた組換えタンパク質によって行われる翻訳後修飾の多くは、タンパク質フォールディング、タンパク質分解処理、ジスルフィド結合形成、グリコシル化[1]を受け実行することができます。 メチロトローフ酵母P.としてピキアパストリスは、その唯一の炭素源としてメタノールを代謝することが可能です。アルコールオキシダーゼ、AOX1、のための強力なプロモーターは、厳重に規制されているとメタノールで誘導し、それが目的の遺伝子の発現のために使用されています。したがって、外来タンパク質の発現は、増殖培地にメタノールを添加することにより誘導することができる[2、3]。 もう一つの重要な利点は、P.パストリスの分泌経路に外来タンパク質を標的とするシグナル配列を使用して、増殖培地中への組換えタンパク質の分泌です。酵母自体がメディアに分泌される内因性のタンパク質やメディアにない追加のタンパク質だけ低いレベルで、異種蛋白質は培地中の全タンパク質の大部分を構築し、タンパク質の精製の手順に従って容易に[3、4]。 （pPICZαA）ここで用いられるベクターは、目的の遺伝子の厳密に調整、メタノール誘導発現のためのAOX1プロモーターを含み、組換えタンパク質の分泌のためのα-因子分泌シグナル、両方E.で選択ゼオシン耐性遺伝子を大腸菌およびピキアおよび c - mycエピトープと組換えタンパク質の検出および精製の ​​ためのポリヒスチジン（6 ×）タグを含むC末端ペプチド。我々はまた、親のベクトル上のc - mycのエピトープを認識する特定の抗 myc - HRP抗体を用いた組換えタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。

プロトコルは、メチロトローフ酵母を用いたタンパク質の発現を説明します<em&gt;ピキアパストリス</em&gt;。エレクトロ酵母細胞の調製、に興味のある遺伝子を持つベクトルの変換<em&gt; P.ピキアパストリス</em&gt;と酵母のDNA精製も行われている。ウェスタンブロット分析およびタンパク質の精製は、このタンパク質の発現のプロトコルの最後の手順を構築する。

微生物真核宿主であるPichia pastorisを用いたタンパク質発現は、迅速かつ大量の組換えタンパク質を生成できる可能性を提供します。

以下のプロトコルでは、メチル栄養要求性酵母を用いたタンパク質発現について説明します。まず、電撃用コンピテント酵母細胞の調製と、目的遺伝子を含むベクターのPichia pastorisへの導入を示し、続いて目的遺伝子が酵母ゲノムに正しく組み込まれたかを確認するための酵母DNA精製ステップを行います。最後に、組換えタンパク質の発現を実施します。こんにちは。ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部、Steven Hallam研究室のMariaです。Helm研究室のMarcusです。本日は、酵母Pichia pastorisにおいて組換えタンパク質を発現させる手順をご紹介します。当研究室では、環境DNAが抽出・保存されており、メタゲノムライブラリーが構築されている未培養微生物のタンパク質を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。メチル栄養酵母であるP. pastorisにおいて組換えタンパク質を発現させるには、目的遺伝子をP. pastoris用ベクターにインフレームでクローニングする必要があります。本実験では、ベクターPPIC Z alpha Aを使用します。このベクターには、目的遺伝子のメタノール誘導発現を厳密に制御するためのAO X oneプロモーター、組換えタンパク質を分泌させるためのα因子分泌シグナル、E. coliおよびPichiaの両方で選択するためのzea resistance遺伝子、そして組換えタンパク質の検出および精製のためのc-mycエピトープとポリヒスチジンタグを含むC末端ペプチドが含まれています。形質転換を行う前に、制限酵素消化により目的遺伝子を含むベクターを線状化します。ここではPME 1酵素を使用しますが、インサートにその制限部位が含まれていない限り、他の制限部位も使用可能です。十分な量の線状化ベクターDNAを得るために、3〜4本の個別のチューブで50 µLの制限酵素消化反応を行い、消化後、すべての溶液を合わせてコンストラクトを濃縮します。AmCon遠心フィルターユニットおよびMicroCon遠心フィルターユニットを用い、PPA dousへの形質導入には、滅菌水5〜10 µLに溶解した5〜20 µgの線状化DNAが必要となります。電撃法用コンピテントPPA dousを準備するには、予定している形質導入の4日前に、SNを含まないAYPDSプレートに細胞をストリークし、30 °Cで1〜2日間、または形質導入の2日前までに単一コロニーが形成されるまで培養します。50 mLのFalconチューブを用い、PPAまたは菌株を5 mLのYPD培地で30 °Cにて一晩培養します。形質転換の前日に、シェーカーに固定するためFalconチューブをフラスコに入れます。一晩培養した培養液0.25 mLを用い、2 Lフラスコに

expression-recombinant-proteins-methylotrophic-yeast-pichia

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メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス

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