の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

この手順の全体的な目的は、培養下で操作した卵巣（OO）部位に由来する発生中の胚を得ることにあります。まず、1匹の雌からドナーの卵巣部位を単離し、培養条件下で目的の操作を行います。次に、プロゲステロンを用いてこれらの細胞を成熟させ、同時にホストとなる雌にゴナドトロピンを注入して産卵を促します。

本手順の第3ステップでは、ドナー細胞をバイタルダイで染色し、ホストとなる雌を準備します。最終ステップでは、ドナー細胞をホストの体腔内へ外科的に移植し、数時間後に移植された卵を回収して受精させます。最終的に、実験的に操作されたドナー由来の、正常に分裂する胚が得られます。

サイトCytesは、通常の胚と同様に採取および解析が可能です。こんにちは。アイオワ大学のダグ・ヒューストンです。本日は、コールドスプリングハーバーのXapコースにて、ホスト転移の手順について解説します。

当研究室では、母性遺伝子産物の役割を研究し、初期のゼブラフィッシュ発生における役割を決定するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。手術を開始する前に、手術領域が消毒されており、新鮮な培地と滅菌済みの器具が準備できていることを確認してください。

針保持器を用いて、縫合針を任意の方向で把持します。麻酔を施した雌のカエルを、湿らせたサージカルワイプの上に仰向けに置きます。小さなアイリスシザーを用いて、下腹部の正中線から外側に1 cmの皮膚切開を行います。

腹筋を切り込まないようにしてください。ピンセットを使用して、筋肉層と周囲の白色の筋膜を持ち上げます。アイリスシザーを用いて、筋肉を直線的に一気に切断します。

切開創を1cmまで広げ、卵巣を露出させます。ピンセットで卵巣を把持し、葉を牽引します。鋏を用いて、体壁のレベルで葉を切除します。

組織を卵母細胞培養液（OCM）を含む90 mmディッシュに入れ、直ちに解剖顕微鏡下で卵巣の品質を確認します。少数の卵母細胞をピンセットで剥離させます。卵母細胞が硬く、サイズと色調が均一である場合は、カエルから必要な量の卵巣組織を採取し、OCMを入れた90 mmペトリ皿に移します。

切開部を閉鎖します。切開線の数ミリメートル外側に針を刺入し、筋肉と筋膜の両方を確実に貫通させます。ピンセットで針を操作し、縫合糸の端まで全て引き抜かないように注意してください。

単純結節縫合とサージョンズノットを用いて創傷を閉鎖します。手法の詳細については、付随する本文に記載されています。皮膚層に対しても同様に縫合を繰り返します。

雌個体を脱イオン水で洗浄し、冷水を入れたリカバリーバケットに入れます。手術終了後、直ちにハサミを用いて卵巣を分画します。個々の葉を切り開いて平らにし、2 cm四方の断片に切り分けます。

清潔な培地で洗浄し、ピンセットを使用します。個々の細胞を分離させるため、5〜6個の断片を新鮮なOCMを入れた90 mmディッシュに移します。まず、断片の1つを小さなディッシュに入れた培地に移し、解剖顕微鏡下に置きます。

時計職人用ピンセットを用いて、3〜500個の卵母細胞を手作業で採取します。2本目のピンセットで、成熟したステージ6の卵母細胞の周囲にある結合組織層を、ストック付近で把持します。1本目のピンセットで、卵母細胞に隣接する卵巣を把持します。

卵母細胞を軽く引っ張り、濾胞層を破ります。組織から卵母細胞を慎重に分離させます。濾胞が除去された卵母細胞には可視的な血管がなく、濾胞が維持されている卵母細胞よりも柔軟な状態になります。

綿栓をした火炎滅菌済みピペットを用いて、100〜150個の卵細胞を8 mLのOCMを含む60 mm培養皿に移します。卵細胞を培養皿に入れたまま18 °Cで保存します。これにより、任意のプロトコルに従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはmRNAを卵細胞にマイクロインジェクションし、その後、18 °Cのインキュベーター内でOCMを用いて培養することが可能になります。

分離から96時間以内に移植に使用する卵母細胞を、移植前日の夜に準備します。必要な卵母細胞を成熟させるため、プロゲステロンを用いてインキュベートします。卵母細胞を含む培地に1 mMのプロゲステロンを16 µL加え、最終濃度を2 µMにします。同日の夜に18 °Cで10～12時間インキュベートし、メス3～5匹にヒト絨毛性ゴナドトロピンを1匹あたり1000 units注射して産卵を誘導します。

移殖前日の夜に、雌個体を室温または18 °Cで一晩静置します。解剖顕微鏡下で、培養細胞が成熟していることを確認してください。生存染料を添加し、10,000 Gs以上で5分間遠心分離します。

デブリによるバックグラウンドを低減するため、各実験群の卵母細胞に適切な生細胞染色剤を 80 µL 加えます。ロッカースタンドを用いて室温で 15 分間インキュベートします。染色された卵細胞を新鮮な o cm の 90 mm ディッシュに移し、軽く回して洗浄します。

細胞の移送に使用するピペットを作成します。ダイヤモンドペンシルを使用し、ピペットのテーパー部分から約2cm下の位置に筋を入れ、きれいに折ります。これにより、卵細胞を収容するのに十分な大きさである1.5 mmのボアを持つピペットが作成されます。

チップの先端を塞がないように、端が滑らかになるまで研磨します。卵母細胞移植。手術は可能な限り迅速に行う必要があります。

麻酔をかけた、質の良い卵を産卵している雌に、前述と同様の切開を行います。この切開は、移植用ボアがちょうど収まる最小限の長さにしてください。1cm未満をピペットで採取します。

実験用の卵母細胞が入ったディッシュを回し、卵母細胞を中央に集めます。準備したパスチャーピペットを使用して、できるだけ多くの卵母細胞を吸い上げます。カエルに転移させる液量を最小限にするため、卵母細胞をピペットの先端に沈殿させます。

ピンセットを使用して、筋肉と筋膜のフラップの片方を掴んで持ち上げます。ピペットの先端を切開部に挿入し、卵細胞がゆっくりと体腔内に流れ込むようにします。すべての卵細胞が転移するまで、この操作を繰り返します。

卵母細胞が切開部から流出するのを防ぐため、筋層を緩めないでください。ピンセットで切開部の両側を掴んで寄せ、細胞が体腔内に収まるようにします。これまでと同様に筋肉と筋膜の層の縫合を開始し、最初の結節を tying するまで上方に張力を維持するように注意してください。

皮膚を縫合します。カエルを脱イオン水で洗浄し、以前と同様に回復させます。手術から2〜3時間後から、カエルは通常通りに産卵を開始します。

30分ごとに通常のスクイージングを行い、メスが産卵を停止するまで卵を回収容器に集めます。 freshly collected spermを1X XMMRで懸濁させたものを4mL加え、室温で4分間インキュベートします。その後、室温の溶液で卵を十分に洗浄します。

XMMRを室温でインキュベートし、活性化と切断を促進させます。ジェリーコートを除去するには、任意のタイミングでシステインを使用してください。転移させた胚は、色に応じて別々のディッシュに分注し、通常の胚として培養します。

通常、移植された卵子の3分の2以上が受精から数分以内に活性化し、動物極で顕著な皮質収縮を示します。ほとんどの実験において、移植された卵子の半分以上が正常な初回卵割を行います。場合によっては、我々の経験上、ホスト卵と比較して卵割が20分ほど遅れることがあります。

移植された胚の30〜60%が正常に原腸陥入し、神経胚期以降まで生存します。移植された胚は、発生の多くの期間を通じてバイタルダイの色を保持します。未注入のコントロール卵細胞由来の胚は、期待通り正常な外見を示します。

対照的に、例えばβ-カテニンとアンチセンスオリゴを注入した卵細胞由来の胚は、中心化（centralized）した外観を呈します。ここまで、培養下で操作した卵細胞から胚を得る方法について説明しました。

この手順を行う際は、健康な成熟したドナー卵子を使用し、かつ高品質な卵を持つホスト雌を用いることが重要です。また、本手法の成功率は、卵子の分離および手術の速度と相関する傾向があります。そのため、一貫した結果が得られるようになるまで、ある程度の習熟が必要な場合があります。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っています。