Name: の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶXenopus卵母細胞のホスト転送法による受精技術。プロゲステロンで成熟を誘導し、宿主雌に外科的に移植して発生胚を得る。この手法は発生生物学研究で重要な応用を持つ。

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著者は、原稿の重要な読書のためにヒューストンの研究室のメンバーに感謝したいと思います。研究は、DWHに与え国立衛生研究所（GM083999）によってサポートされています

<ol><li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+in+vitro%3A+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li>
<li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li>
<li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+Xdazl%2C+a+germ+plasm-localized+RNA%2C+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li>
<li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+mother+can+help%3A+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li>
<li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRugh%2C+R+%22Experimental+Embryology%3A+Techniques+and+procedures%22">Experimental Embryology: Techniques and procedures</a>. , Burgess. Minneapolis, MN. (1962).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li>
<li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+and+oocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li>
<li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability%2C+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li>
<li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+beta-catenin+establishes+a+%27dorsal+signal%27+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li>
<li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li>
<li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuck%2C+MV+%22A+comparative+methods+approach+to+the+study+of+oocytes+and+embryos%22">A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos</a>. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).</li>
</ol>

動物実験は、アイオワIACUC委員会の大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

転送が成功するには、受精し、卵母細胞の&gt; 50％（図3）の正常な切断になります。一般的に転送卵母細胞の間に30〜60パーセントは、神経胚の段階を過ぎても存続します。我々は通常、表現型を視覚化するだけでなく、分析のいくつかのタイプ（その場で、RT - PCR）のための十分な胚が得られる実験群あたり75から150卵母細胞を、転送する。実質的により多くの卵母細胞を注入すると、大幅に収率を高めるためにいないようです。また、グループごとに少なくとも30卵母細胞は、少なくともいくつかは、原腸陥入によってそれを作ることを保証するために転送する必要があります。染料は、特定の状況に悪影響を与えるかもしれないが重要な染料は、一般的に、ここで説明する濃度と条件の下で胚には影響しません。古典的には、ニュートラルレッドは、強いタングステンベースの光源にさらされると光毒性の特性を有することが報告されている。最近では、ミールとヒースマン（2008）は胚を低温でインキュベートしている場合はビスマルクブラウンは、いくつかの毒性作用を持つことができることが報告されている。このような過度に卵母細胞を死んで、温度と照明の極端を避けることではないなどの基本的な予防策は生体...

ソリューションとレシピ： OCM（卵母細胞の培養液、ワイリーらから変更、1996。） <table border="0"><tbody><tr><td> 70パーセントリーボビッツのL - 15培地（L -グルタミンを含む） </td><td> （インビトロジェン11415〜064） </td></tr><tr><td> 0.4 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA、フラクションV） </td><td> （シグマA - 9418〜50グラム） </td></tr><tr><td> 1Xペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> （シグマP - 0781） </td></tr><tr><td colspan="2"> 5N NaOHでpHを7.6から7.8に調整する</td></tr><tr><td colspan="2"> 18℃で新鮮毎週、ストアを行う</td></tr></tbody></table> 10X MMR（Marcの改変リンゲル液;。ズックら 、1998） <table border="0"><tbody><tr><td> 1MのNaCl </td></tr><tr><td> 20mMのKClを</td></tr><tr><td> 20mMのCaCl 2を </td></tr><tr><td> 10mMのMgCl 2 </td></tr><tr><td> 150mMのHEPES </td></tr><tr><td> pHが7.6から7.8に調整する</td></tr><tr><td> 4℃で</td></tr></tbody></table>麻酔液<table border="0"><tbody><tr><td>を1g / L 3 - アミノ安息香酸エチルエステル（MS222） </td><td> （シグマA - 5040） </td></tr><tr><td colspan="2"> 0.7グラム/ L重炭酸ナトリウム</td></tr><tr><td colspan="2"> Amquel処理水に溶かす</td></tr><tr><td colspan="2">毎週新鮮な確認</td></tr></tbody></table>プロゲステロンの株式<table border="0"><tbody><tr><td> 100％エタノール、10 mMのプロゲステロン（シグマP - 0130） </td></tr><tr><td> 500分の1株式/実用的なソリューションのための100％エタノールで1 mMに希釈する</td></tr><tr><td> -20℃で保存</td></tr></tbody></table>バイタル色素（ヒースマンら 、1991から改変） <table border="0"><tbody><tr><td>青：0.1％ナイルブルー</td><td> （アルドリッチ121479 - 5G）、 </td></tr><tr><td>赤：0.25％ニュートラルレッド</td><td> （シグマN - 6634）、 </td></tr><tr><td>ブラウン：1％ビスマルクブラウン</td><td> （シグマB - 2759）、 </td></tr><tr><td colspan="2">グリーン（80μlの青+80μlの茶色）、 </td></tr><tr><td colspan="2">モーブ（80μlの青+80μlの赤）。 </td></tr><tr><td colspan="2">第六色、オレンジ色は（赤、80μlの+80μlの茶色）、また使用されるが、茶色と区別することは困難ですできます。 </td></tr></tbody></table>ブルー、レッドとブラウンの株式は、50 mLチューブに、脱イオン水で作ら振盪しながら20分間インキュベートし、臨床遠心機でスピンされています。上清をマイクロチューブに小分けして-20℃で保存されています

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

初期の開発を脊椎動物に母性遺伝の分子の寄与を研究することは、しばしば時間と母性効果変異動物を生成するために必要な費用によって妨げられている。さらに、例えば、 アフリカツメガエルやゼブラフィッシュなどの生物の遺伝子機能を過剰発現または抑制する手法の多くは、十分にそのようなWntシグナル伝達などの重要な母体のシグナル伝達経路を標的に失敗する。 アフリカツメガエルでは、培養卵母細胞での遺伝子機能を操作し、その後それらを肥やすことはある程度までこれらの問題を改善することができます。卵母細胞は、手動で、ドナーの卵巣の組織からdefolliculated必要に応じて注射したり、文化の中で処理し、成熟を誘導するためにプロゲステロンによって刺激されています。それらはホストの卵管を通じて転と変更し、受精に必要なゼリーのコートを取得される、すると次に、卵母細胞は、排卵ホスト女性のカエルの体腔内に導入されています。結果として得られる胚は、その後、目的のステージに上げ、あらゆる実験的摂動の影響について分析することができる。このホストベースの転送方式は、初期の開発の基本的なメカニズムを暴くのに非常に有効であったと他の脊椎動物のモデル生物では利用できない実験的な幅広い可能性を可能にしました。

施肥のための手順<em&gt;アフリカツメガエル卵母細胞</em&gt;ホストの転送方法によって。

母性遺伝分子が脊椎動物の初期発生に果たす寄与の研究は、...に要する時間とコストによって妨げられることが多い。

この手順の全体的な目的は、培養下で操作した卵巣（OO）部位に由来する発生中の胚を得ることにあります。まず、1匹の雌からドナーの卵巣部位を単離し、培養条件下で目的の操作を行います。次に、プロゲステロンを用いてこれらの細胞を成熟させ、同時にホストとなる雌にゴナドトロピンを注入して産卵を促します。本手順の第3ステップでは、ドナー細胞をバイタルダイで染色し、ホストとなる雌を準備します。最終ステップでは、ドナー細胞をホストの体腔内へ外科的に移植し、数時間後に移植された卵を回収して受精させます。最終的に、実験的に操作されたドナー由来の、正常に分裂する胚が得られます。サイトCytesは、通常の胚と同様に採取および解析が可能です。こんにちは。アイオワ大学のダグ・ヒューストンです。本日は、コールドスプリングハーバーのXapコースにて、ホスト転移の手順について解説します。当研究室では、母性遺伝子産物の役割を研究し、初期のゼブラフィッシュ発生における役割を決定するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。手術を開始する前に、手術領域が消毒されており、新鮮な培地と滅菌済みの器具が準備できていることを確認してください。針保持器を用いて、縫合針を任意の方向で把持します。麻酔を施した雌のカエルを、湿らせたサージカルワイプの上に仰向けに置きます。小さなアイリスシザーを用いて、下腹部の正中線から外側に1 cmの皮膚切開を行います。腹筋を切り込まないようにしてください。ピンセットを使用して、筋肉層と周囲の白色の筋膜を持ち上げます。アイリスシザーを用いて、筋肉を直線的に一気に切断します。切開創を1cmまで広げ、卵巣を露出させます。ピンセットで卵巣を把持し、葉を牽引します。鋏を用いて、体壁のレベルで葉を切除します。組織を卵母細胞培養液（OCM）を含む90 mmディッシュに入れ、直ちに解剖顕微鏡下で卵巣の品質を確認します。少数の卵母細胞をピンセットで剥離させます。卵母細胞が硬く、サイズと色調が均一である場合は、カエルから必要な量の卵巣組織を採取し、OCMを入れた90 mmペトリ皿に移します。切開部を閉鎖します。切開線の数ミリメートル外側に針を刺入し、筋肉と筋膜の両方を確実に貫通させます。ピンセットで針を操作し、縫合糸の端まで全て引き抜かないように注意してください。単純結節縫合とサージョンズノットを用いて創傷を閉鎖します。手法の詳細については、付随する本文に記載されています。皮膚層に対しても同様に縫合を繰り返します。雌個体を脱イオン水で洗浄し、冷水を入れたリカバリーバケットに入れます。手術終了後、直ちにハサミを用いて卵巣を分画します。個々の葉を切り開いて平らにし、2 cm四方の断片に切り分けます。清潔な培地で洗浄し、ピンセットを使用します。個々の細胞を分離させるため、5〜6個の断片を新鮮なO

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生物学

、そのまま溶解、及び/または分画アフリカツメガエルの卵は、実験の様々な場合に便利です。このプロトコルは、産卵を誘発卵を収集し、dejelly、及び損傷した卵を除去するために卵をソートする方法を示しています。...

アフリカツメガエル女性から卵子を入手

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示しています...

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

このビデオプロトコルは、トランスジェニックを生成する方法を示しています...

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。...

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。...

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

私たちは、Xenopus laevisの未熟卵子の操作方法、卵子の卵子へのin...

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

私たちは、有能な外胚葉で応答を誘発することができる遺伝子の発現クローニングのためのXenopus卵子と動物キャップシステムについて説明し、そのような遺伝子のその後の解析技術について議論します。このシステムは、幅広い遺伝子産物の機能同定に役立ちます。...

用いた機能クローニング<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞発現システム

単一卵胞の単離、細胞質RNAマイクロインジェクション、周囲の細胞層の除去、およびXenopus卵子におけるタンパク質発現のための最適化された手順が説明されています。さらに、リガンド依存性イオンチャネルを用いた電気生理学的実験における迅速な溶液変化のための簡単な方法が提示されます。...

アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。...

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null...

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

学ぶXenopus卵母細胞のホスト転送法による受精技術。プロゲステロンで成熟を誘導し、宿主雌に外科的に移植して発生胚を得る。この手法は発生生物学研究で重要な応用を持つ。

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

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