の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

この手順の全体的な目的は、培養下で操作した卵巣（OO）部位由来の発育中の胚を得ることです。まず、1匹の雌からドナー卵巣部位を単離し、培養下で目的の操作を行います。次に、プロゲステロンを用いてこれらの細胞を成熟させ、同時にホストとなる予定の雌にゴナドトロピンを注射して産卵を促進させます。

手順の第3ステップは、ドナー細胞を生存染料で染色し、ホストとなる雌を準備することです。手順の最終ステップは、ドナー細胞をホストの体腔に外科的に移植し、数時間後に移植された卵を回収して受精させることです。最終的に、実験的に操作されたドナー由来の正常に分裂する胚が得られます。

細胞は通常の胚と同様に採取および解析することが可能です。こんにちは。アイオワ大学のダグ・ヒューストンです。本日はコールド・スプリング・ハーバーのXapコースにて、ホスト転移の手順について解説します。

当研究室では、母性遺伝子産物の役割を研究し、初期のzap発生における役割を決定するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。手術を開始する前に、手術部位が消毒され、新鮮な培地と滅菌済みツールが準備できていることを確認してください。

針ホルダーで縫合針を希望の向きに把持します。麻酔をかけた雌のカエルを、湿らせたサージカルワイプの上に仰向けに置きます。小さなアイリスシザーを用いて、腹部下方の正中線外側に、皮膚を1 cm切開します。

腹筋を切り込まないようにしてください。ピンセットを使用して、筋肉層と周囲の白色の筋膜を持ち上げます。アイリス剪刀を用いて、筋肉を直線的に一気に切断します。

切開線を1cmまで広げ、卵巣を露出させます。ピンセットで卵巣を把持し、葉を牽引します。はさみを用いて、体壁の高さで葉を切り離します。

組織を卵母細胞培養液（OCM）を含む90 mmディッシュに入れ、直ちに解剖顕微鏡下で卵巣の品質を評価します。ピンセットを用いて、数個の卵母細胞を剥離させることができます。卵母細胞がしっかりしており、サイズと色調が均一である場合は、カエルから必要な量の卵巣組織を採取し、OCMが入った90 mmペトリ皿に移します。

切開部を閉鎖します。切開部位から数ミリメートル外側に針を刺し、筋肉と筋膜の両方を確実に貫通させます。ピンセットを使用して針を操作し、縫合糸の末端まで完全に引き抜かないように注意してください。

単純結節縫合とサージョンズノットを用いて創部を閉鎖します。手技の詳細については、付属のテキストに記載されています。皮膚層についても同様に縫合を繰り返します。

雌個体を脱イオン水で洗浄し、冷水を満たした回復用バケットに入れます。手術終了直後、ハサミを用いて卵巣を細分します。個々の葉を切開して平らにし、2 cm四方の断片に切り分けます。

清潔な培地で洗浄し、ピンセットを使用します。個々の細胞を分離させるため、5〜6個の断片をOCMが入った新しい90mmディッシュに移します。まず、断片の1つを小さな培地入りディッシュに移し、解剖顕微鏡の下に置きます。

時計職人用ピンセットを使用して、3〜500個の卵母細胞を手動で採取します。2本目のピンセットで、ストック付近にある完全に成長したステージ6の卵母細胞を囲む結合組織層を掴みます。1本目のピンセットで、卵母細胞に隣接する卵巣を掴みます。

卵母細胞を軽く引っ張り、卵胞層を切り裂きます。組織から卵母細胞を慎重に分離します。脱卵胞化した卵母細胞には目に見える血管がなく、卵胞が維持されている卵母細胞よりも柔らかくなります。

綿栓をした火炎滅菌済みピペットを用いて、100〜150個の卵細胞を、8 mLのOCMを含む60 mm培養ディッシュに移します。卵細胞をディッシュに入れたまま18 °Cで保存します。これで、任意のプロトコルに従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはmRNAをマイクロインジェクションし、その後、18 °Cのインキュベーター内でOCMを用いて培養することができます。

分離後96時間以内に移植に使用するため、移植前日の夕方に準備を行います。必要な卵母細胞にプロゲステロンを添加して成熟させます。卵母細胞を含む培地に1 mMプロゲステロンを16 µL加え、最終濃度を2 µMにします。同日の夕方に18 °Cで10〜12時間インキュベートし、その後、産卵を誘発するために雌3〜5匹にヒト絨毛性ゴナドトロピンを1匹あたり1000 units注射します。

移植の日の朝、雌を室温または18 °Cで一晩置いておく。解剖顕微鏡下で、培養した卵母細胞が成熟していることを確認する。生存染料を加え、10,000 ×g 以上で5分間遠心分離する。

デブリによるバックグラウンドを低減させるため、各実験群の卵細胞に適切な生存染料を 80 µL 加えます。ロッカーステッパーを用いて室温で 15 分間インキュベートします。染色された卵細胞を新鮮な o cm が入った 90 mm ディッシュに移し、軽く回転させて洗浄します。

細胞の転送に使用するピペットを作成します。ダイヤモンドペンシルを使用して、ピペットのテーパー部分から約2cm下の位置に切り込みを入れ、きれいに折断します。これにより、卵母細胞を収容するのに十分な1.5 mmの内径を持つピペットが作成されます。

先端を閉じないように注意しながら、縁が滑らかになるまで研磨します。卵母細胞移植を行います。手術は可能な限り迅速に実施してください。

麻酔を施し、良質な卵を産んでいる雌に、前述と同様に切開を加えます。この切開は、移送用ボアがちょうど収まる最小限の長さにしてください。1 cm未満をピペットで採取します。

実験用の卵細胞が入ったディッシュを回転させ、卵細胞をディッシュの中央に集めます。用意したパステールピペットを用いて、可能な限り多くの卵細胞を吸い上げます。カエルに移行させる液量を最小限にするため、卵細胞をピペットの先端に沈殿させます。

ピンセットを使用して、筋肉と筋膜のフラップの一方を掴んで持ち上げます。ピペットの先端を切開部位に挿入し、卵母細胞が体腔内にゆっくりと流れ込むようにします。すべての卵母細胞が転移するまでこの工程を繰り返します。

卵母細胞が切開部から流出するのを防ぐため、筋肉層を離さないようにしてください。ピンセットで切開部の両側を掴んで寄せ、細胞を体腔内に収めます。これまでと同様に筋肉および筋膜層の縫合を開始し、最初の結び目を結ぶまで上方にテンションをかけたままにするよう注意してください。

皮膚を縫合します。カエルを脱イオン水で洗浄し、前述と同様に回復させます。手術後2〜3時間で、カエルは通常通りに産卵を開始します。

雌が産卵を停止するまで、30分ごとに通常のスクイージングを行い、卵を回収皿に回収します。1X MMRに懸濁させた新鮮な精子懸濁液4 mLを加え、室温で4分間インキュベートします。その後、室温の溶液で卵を十分に洗浄し、洗い流します。

まず、XMMRを室温でインキュベートし、活性化と切断を促進させます。ジェリーコートを除去するには、任意のタイミングでシステインを使用してください。その後、転移させた胚を色に応じて別々のディッシュに分注し、通常の胚と同様に培養します。

通常、移植された卵子の3分の2以上が受精から数分以内に活性化し、動物極で顕著な皮質収縮を示します。ほとんどの実験において、移植された卵子の半分以上が正常な初回卵割を行います。場合によっては、我々の経験上、宿主卵に比べて卵割が20分ほど遅れることがあります。

移植された胚の30〜60%が正常に原腸陥入し、神経胚期まで生存します。移植された胚は、発生の数日間にわたってバイタルダイの色を保持します。未注入の対照細胞から得られた胚は、予想通り正常な外観を示します。

対照的に、例えば$\beta$-cateninとアンチセンスオリゴを注入した卵細胞由来の胚は、中心化（centralized）した外見を呈します。以上で、培養下で操作した卵細胞から胚を得る方法について説明しました。

本手順を行う際は、健康で十分に成熟したドナー卵母細胞から開始し、高品質な卵を持つホスト雌を使用することが重要です。また、本手法の成功率は、卵母細胞の分離および手術を行う速度と相関する傾向があります。そのため、安定した結果を得るまでには、ある程度の習熟が必要となる場合があります。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。