DNA修復タンパク質の作用のメカニズムを調べるためにストップトフロー速度論の手法の適用

本動画では、DNAミスマッチ修復タンパク質MutS2-MutS6の反応速度論を測定するための2つのストップトフロー法について解説します。MutS2-MutS6はDNA中の塩基対ミスマッチを認識し、ATPを燃料とする反応により修復を指示します。1つ目の手法では、DNAのGTミスマッチ隣接部位に配置された2-アミノプリン塩基の蛍光増強により、MutS2-MutS6のDNAへの結合を測定します。反応物をストップトフロー装置で混合し、時間経過を追跡することで速度定数を決定します。

2番目の手法では、蛍光性リン酸結合タンパク質レポーターを用いてMush2-Mush6 ATPase活性を測定します。反応物をストップトフロー装置内で混合し、経時的にモニターします。ATP加水分解およびリン酸放出の速度定数を決定することで、得られた速度論的データからDNAミスマッチ修復におけるMush2-Mush6の作用機序を明らかにします。

こんにちは。ウェズリアン大学分子生物学・生化学科のMONI研究室のNoah Biroです。こんにちは、同じくウェズリアン大学のMan研究室のDJ Jです。そして、JI研究室のChris Dsetです。

本日は、ミリ秒単位の時間スケールで反応速度をモニタリングするための、2つの蛍光ベースのアッセイをご紹介します。当研究室ではこれらの手法を用いて、DNA修復タンパク質MutS（MutS2/MutS6）がDNA内のミスマッチ塩基対にどのように結合し、修復を開始するかを研究しています。それでは始めていきましょう。

本手順を開始する前に、必要なタンパク質およびDNA試薬を準備しておく必要があります。あらかじめE. coliで過剰発現させ、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーで精製したs visier mush two mush sixタンパク質を入手してください。DNA試薬を作成するには、蛍光ヌクレオチドアナログである2-アミノプリンで修飾された一本鎖DNAを購入し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で鎖を精製して精製し、これらをアニーリングさせて、GTミスマッチに隣接して2-アミノプリンを持つミスマッチ二本鎖DNAを生成します。

同様に、未修飾の単鎖DNAから非標識DNAを調製します。ここで使用するDNA配列は、本プロトコルの記述部分で確認できます。この手順全体を通して、蛍光不純物を最小限に抑えるため高品質な化学試薬を使用し、高い実験的整合性を確保してください。

また、ストップフロー装置を詰まらせる可能性のある粒子を除去するため、すべてのストック溶液を0.2 µmのメンブレンでろ過してください。DNA結合実験の準備として、サンプル1つあたり最終容量400 µLでサンプルを用意します。これは約10回のキネティックトレースに十分な量です。サンプルは氷上で保持してください。

タンパク質の活性を維持するため、DNAサンプルを0.12 µMに、mush two mush sixサンプルを0.8 µMの濃度に、DNA結合バッファーを用いて調製します。これにより、ストップトフローでの1:1混合後の最終濃度は、DNAが0.06 µM、mush two M sixが0.4 µMとなります。

ストップトフロー装置は、駆動モーターを使用して、反応物溶液を駆動シリンジから混合装置へと同時かつ迅速に押し出します。その後、混合溶液はデータ収集のために観測セルへと流れ込みます。まず、コンピュータとコントローラーの電源が切れていることを確認してください。

次に、循環水槽を起動してランプを冷却し、ランプを点灯させます。モノクロメーターを目的の励起波長である315 nanometersに設定します。2-アミノプリンの場合、SL幅を目的の値に設定してください。

光電子増倍管（PMT）に350 nmカットオフフィルターを装着し、2つのアミノプリン蛍光信号を収集します。コントローラーとコンピュータの電源を入れます。次に、恒温水槽の電源を入れます。

これにより、駆動シリンジ周囲のウォータージャケットが満たされ、実験中の所望の温度反応性が維持されます。最後に、P-M-T-H-V制御メニューからストップフロープログラムを実行します。PMT電圧を設定します。この電圧は、PMT感度を調整するために最初は可変にできますが、その後は一定に保持する必要があります。

実験中、バックグラウンドの電気ノイズを補正するために暗電流を測定します。次に、ストップトフロー駆動シリンジと観測セルを洗浄します。サンプルロードバルブをロード位置に設定します。

1 mLシリンジに脱イオンろ過水を充填します。シリンジをドライブシリンジの下にあるローディングポートに取り付け、2本のシリンジの間に水を押し出します。この操作をそれぞれ2回繰り返します。

実験に使用するドライブシリンジを準備します。次に、観察セルを洗浄するため、ドライブシリンジに水を満たします。サンプルロードバルブをfireポジションに切り替えます。

シリンジドライブ調整コマンドを使用してドライブプレートを下げ、観察セルを通過して出口ラインへ至るように水を押し出します。このとき、ドライブシリンジのプランジャーを最後まで押し切りすぎないよう注意してください。最後に、ドライブプレートを上げてバルブをロード位置に切り替えます。

反応バッファーで1回洗浄し、シリンジ内を空にします。DNA結合実験を開始するには、各サンプルをチューブから新しい1 mLシリンジに移します。各シリンジをローディングポートに取り付け、溶液をドライブシリンジ内に押し出します。

2本のシリンジ間で溶液を断続的に押し出し、気泡を完全に取り除きます。次に、ドライブプレートを下げてドライブシリンジの上部に接触させます。データ収集を行うには、「set time channels」ウィンドウを開きます。

データ解析のデータ収集チャネルモードと、収集するトレース数を選択します。1000個のデータポイントが収集されるデータ収集時間を入力してください。次に、バルブをfireポジションに設定し、データ収集ボタンをクリックします。

この操作により、mush 2、mush 6、およびDNAの混合が開始され、続いて反応液が観察領域に導入されます。2-アミノプリンからの細胞蛍光放出がモニタリングされます。高品質なデータセットを得るために、少なくとも5つのキネティックトレースを収集し、実験完了後にファイルを保存してください。

各データファイルを開き、複数のキネティックトレースの平均を算出します。次に、平均化されたデータファイルを保存し、解析のためにグラフ作成ソフトにエクスポートします。最後に、ランプの電源を切り、シリンジと観察セルを水で十分に洗浄してください。

その後、循環水槽以外の残りの装置の電源を切ります。ランプを冷却するため、循環水槽はさらに15分間作動させたままにします。mush 2からmush 6のミスマッチDNAへの結合に関するキネティックデータは、単一指数関数によって最適にフィッティングされ、10⁷ M⁻¹ s⁻¹のオーダーの速い結合速度定数が得られました。同様のストップトフロー実験により、mush 2からmush 6のミスマッチDNA複合体の解離速度が得られ、これは0.01から0.02 s⁻¹という非常に遅い速度で起こります。

これらの結果は、DNA修復反応中にMush2-Mush6がミスマッチ塩基対に結合する速度と親和性を直接的に測定したものです。次に、Mush2-Mush6のATPase活性を測定するために、ストップトフロー実験を行います。

本アッセイの定常状態前の条件において、バックグラウンドのリン酸レベルを最小限に抑えるため、タンパク質およびDNAの精製を含む試薬調製のすべての段階でガラス製品の使用を避けることが極めて重要です。TP加水分解後のリン酸放出を測定するレポーターとして、E. coliから精製しMDCC蛍光色素で標識したリン酸結合タンパク質（PBP）を使用します。MDCC-PBPは、定常状態前のATP加水分解およびリン酸放出キネティクスの強力なレポーターとなります。これはリン酸に迅速かつ高親和性で結合し、その結果、MDCCの蛍光が大幅に増加します。

4 µMのmushおよび2 µMのmush 6タンパク質を含むサンプルを、6 µMのミスマッチDNAの有無にかかわらず調製します。別途、不純物として混入しているリン酸を回収するため、1 mMの freshly dissolved HEPおよび20 µMのM-D-C-C-P-V-Pを含むサンプルを調製します。これらのサンプルにプリンヌクレオシドホスホリラーゼと7-メチルグアニンを加え、氷上で少なくとも20分間インキュベートします。

前述の手順に従ってストップフロー装置を準備します。さらに、プリン、ヌクレオシド、ホスホリル、および7-メチルグアニンの溶液を用いて、ドライブシリンジからリン酸汚染物質を拭き取ります。20分間インキュベートします。励起波長を425 nmに設定し、M-D-C-C-P-B-Pの蛍光検出にはPMTに450 nmのカットオフフィルターを使用します。

前述の手順に従って、サンプルをドライブシリンジにロードします。データ収集パラメータを設定し、「collect data」をクリックして、mush 2〜mush 6をTPおよびM-D-C-C-P-B-Pと混合させ、mush 2〜mush 6によるリン酸放出と、それに伴うM-D-C-C-P-P-P蛍光の経時的な増加をモニターします。高品質なデータセットを得るために、少なくとも5本のキネティックトレースを収集してファイルを保存し、複数のキネティックトレースを平均化して、前述の手順に従って解析用にデータファイルをエクスポートします。リン酸濃度とM-D-C-C-P-P-P蛍光の間の線形関係を決定するための検量線を準備します。まず、ストップトフローを用いて、同一の実験条件下でM-D-C-C-P-P-Pを異なる濃度のリン酸と混合させます。

次に、検量線を作成するために、最大M-D-C-C-P-P-P蛍光を各リン酸濃度に対してプロットし、その傾きを用いてmush two mush six反応におけるリン酸濃度を決定します。リン酸濃度を時間に対してプロットし、データを指数関数および線形関数にフィッティングさせます。この関数は、定常状態に達する前のATP加水分解とリン酸放出のバースト現象と、それに続く反応の線形定常状態相を表しています。速度論的データから、mush two mush sixはATPを加水分解し、最初の触媒ターンオーバーにおいて1.4 per secondという速さでリン酸を放出することが示されました。

続いて、反応における緩慢なステップにより、その後のターンオーバーは7倍遅い0.2 per secondの定常状態触媒定数に制限されます。しかし、mush to mush sixがミスマッチDNAに結合すると、ATP加水分解とリン酸放出のバーストは抑制されます。これらの結果は、ミスマッチ塩基対とDNAに結合することで、mush too mush sixがATP結合状態に移行することを直接的に示しています。

この切り替えは、DNA修復反応における重要なステップです。ここでは、ストップフロー装置を使用して反応の速度をリアルタイムで測定する方法を説明しました。このような測定により、MASH twoおよびMASH sixの作用機序とDNAミスマッチ修復に関する理解が進展しました。

この種の実験を行う際は、高純度のDNAやタンパク質を含む高品質な試薬を使用すること、またATPアッセイにおけるリン酸汚染に細心の注意を払うことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。