Name: 二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-02T17:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 学ぶ二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡法で、アポトーシス時のミトコンドリア断片化を定量化する手法。この非侵襲的技術は細胞内オルガネラ動態をリアルタイムで評価し、蛍光標識不要で構造変化を検出できる。

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この研究ではマイクロミラーデバイスはN Boustanyにウィテカー財団の助成金RG - 02から0682によって賄われていた。進行中の作業は、N. Boustanyに助成NSF - DBI - 0852857によって運営されている。 RMパスターナックは、部分的にラトガース大統領大学院フェローシップによってサポートされていました。我々はまた、光のフィルタリング戦略に関する有用な議論のための我々の研究と博士DNのメタクサスで使用されているiBMK細胞のために博士E.ホワイトに感謝したいと思います。

<ol><li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Subcellular+Texture+by+Optical+Gabor-Like+Filtering+with+a+Digitial+Micromirror+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device.</a> Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).</li>
<li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+size+discrimination+of+submicron+objects+using+optical+Fourier+filtering+based+on+two-dimensional+Gabor+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive size discrimination of submicron objects using optical Fourier filtering based on two-dimensional Gabor filters.</a> Optics Express. 17 (14), 12001-12012 (2009).</li>
<li>Zheng, J. -Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+scatter+imaging+with+a+digital+micromirror+device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical scatter imaging with a digital micromirror device.</a> Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).</li>
</ol>

方法のいくつかの側面がで、発明の開示、ラトガース大学ドケット＃09から049まで含まれています。

方法は、例えば、粒子のサイズや向きをコード化することができるオブジェクトの収量形態学的地図上に記載。この構造情報は、いくつかの方法で使用することができます。 <ol><li>それは特定の治療中に変更され、さらに特定の分子と生化学的アッセイでこれらの領域を分析are組織または細胞領域を識別するために、初期画面として使用することができます。 </li><li>それは、細胞内構造体（この方法による）の定量的特性を持つ分子の活性を同時に理解する（蛍光による）を結合した​​細胞のマルチモーダル歩留まり解析する蛍光と組み合わせて使用​​することができます。 </li><li>特定の構造物の応答が特定の生物学的プロセス（例えばアポトーシス）の特定のオルガネラ活性と相関されると、メソッドはこの構造応答に影響を与えるさまざまな遺伝的および実験条件のための画面への蛍光ラベルすることなく使用することができます。 </li></ol>これまでに我々は、メソッドが30 - 50nmの[2]オーダーの粒径の違いに敏感であることが示されている。我々は、メソッドが粒子の配向とアスペクト比の変化に敏感であることが示...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>低グルコースDMEM</td></tr><tr><td>Liebowitz L15培地</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>フェノールレッド不含</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ脳抽出物</td><td>Clonetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スタウロスポリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>DMD</td><td>Texas Instruments</td><td>TI 0.7 XGA DMD 1100</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascase 512B</td><td>高（16ビット）ダイナミックレンジCCD</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Coolsnap cf</td><td></td></tr></tbody></table>

二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

我々は、染色生細胞内で細胞小器官の形態と組織に起因する細胞内のテクスチャを測定することができる微細な楽器を示しています。提案された楽器は、オルガネラのサイズと形状のナノスケールの変化にラベルフリーの光学顕微鏡の感度を拡張し、そのようなプログラム細胞死や細胞のような基本的な生物学的プロセスを、根底にあるオルガネラダイナミクスに関する構造機能相関の研究を加速するために使用することができます。分化。顕微鏡は簡単に既存の顕微鏡のプラットフォーム上で実装することができますので、科学者が無制限にアクセスできる提案手法を実装して使用できる個々の研究室、に普及することができます。 提案手法は、2次元光ガボールフィルタを介して細胞を観察することによって、細胞下構造を特徴づけることができます。これらのフィルタは、ナノスケール（10のnmの）感度、非球状細胞内小器官の大きさや向きに関係する特定の形態学的属性と意味するように調整することができます。弾性散乱によって生成されたコントラストに基づいて、一方で、技術は、形態学的測定値を抽出する詳細な逆散乱モデル上または三重理論に依存しません。この手法は、したがって、正確な理論的なスキャッタ記述が容易に与えされていない非球面小器官に適用可能であり、その機能を評価するために染色生細胞内で取得することができる独特の形態学的パラメータが用意されています。テクニックは、離散物体の強度ではなく、変換するオブジェクトのフィールドを直接操作するという点でデジタル画像処理に比べて有利である。それは、高い画像のサンプリングレートに依存しないため、このように非常に高倍率デジタル画像の蛍光共焦点顕微鏡による個々のオルガネラのセグメンテーションと再構築を超えて細胞小器官の構造の研究を促進、急速に一度に細胞の数百の中で形態学的活性をスクリーニングするために使用することができます。ビューの限られたフィールドの。 このデモでは、方法論を説明するために海洋性珪藻からのデータを示す。我々はまた、メソッドが関連する生物学的な文脈に適用する方法のアイデアを与えるために生きている細胞から収集された予備的なデータを示しています。

我々は、単一の生細胞内で細胞内動態を測定するためのフィルタリングガボールのように基づいて、暗視野顕微鏡法を示しています。技術は、ミトコンドリアの断片化などの細胞小器官の構造の変化に敏感です。

私たちは、未染色の生細胞内におけるオルガネラの形態および組織化に起因するサブセルラーテクスチャ（細胞内微細構造）を測定できる顕微鏡装置を提示します。

このビデオでは、光学散乱顕微鏡を用いて、アポトーシス中のミトコンドリア断片化を定量化します。本プロトコルにおいて、光学散乱顕微鏡は通常蛍光を必要としませんが、検証目的で蛍光画像を取得します。イメージングシステムのセットアップ後、細胞をMIT tracker greenで標識し、staurosporinで処理してアポトーシスを誘導します。2時間以内に細胞小器官の配向の変化を検出するために、光学データを取得します。ミトコンドリア断片化の開始は、細胞内粒子の配向度の低下を示す光学散乱データを用いて測定できます。その後、光学散乱データとミトコンドリアを含む蛍光領域を相関させることで、データの検証を行います。こんにちは。ラトガース大学生物医学工学科、バイオオプティクス研究室のナダ・ブスタニです。同じくバイオオプティクス研究室のロブ・パックです。そして、同じくバイオ研究室のディーンです。本日は、蛍光染料に依存しない手法を用いて、細胞内小器官の形態学的ダイナミクスを定量化する手順についてご紹介します。当研究室では、アポトーシス（プログラム細胞死）における細胞内構造の動的な変化を研究するために、この手法を用いています。それでは、手順を開始しましょう。まず、手袋を着用した手を70% ethanolで滅菌します。次に、調製した100 nMのMitoTracker Greenストック溶液と、あらかじめ温めておいたBAEC細胞培養培地を、消灯したフード内に設置し、すべての表面を滅菌します。続いて、カバーガラス上に細胞を播種した6ウェル培養皿をフード内に設置します。真空ラインに接続されたペーストピペットを使用してください。ウェルから細胞培地を除去します。次に、細胞（ミトコンドリア）を標識するため、各ウェルに標識培地を2 mLずつ直ちに追加します。室内の直射光にさらされないよう組織培養プレートにカバーをかけ、速やかに細胞をインキュベーターに戻します。細胞を37°Cで45分間インキュベートします。その間に光学系のセットアップを行い、まず水銀アークランプを点灯させます。次に、コンピューター、顕微鏡カメラ、およびレーザーを起動し、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）をスピニングディフューザーに装着します。次に、顕微鏡の接眼レンズを覗き、光学的な導入（ launched）が調整されているかを確認します。視野がレーザー光で明るく照らされているはずです。サンプルをロードするには、63 x 油浸対物レンズを完全に下げた状態で、レンズの上に浸漬油を1〜2滴落とします。次に、gradiと呼ばれる10 µm間隔の格子線が描かれたスライドをステージに設置し、対物レンズを上げてオイルでピントを合わせます。次に、コンデンサー視野の六角形の縁に焦点を合わせます。中央ケーラー照明に調整されるまで操作を停止してください。六角形の縁を接眼レンズの中央に配置し、ピントを鋭く合わせます。次に、コンデンサー絞り開口調節ノブを使用して、コンデンサー絞り開口を視野の中央に合わせます。IP labを起動し、カメラを操作するための設定を入力してください。カメラがフレーム転送モードに設定されていることを確認します。「acquire focus」コマンドを実行してライブプレビューを開始します。次に、インデックスの接頭辞と、画像を保存するファイル保存先を設定します。次に、RS画像を開始します。CoolSnapカメラの動作設定を指定してください。クロッキングモードは「Normal」に設定してください。DMDソフトウェアを起動します。スクリプトメニューからダークフィールドアイリスを選択します。次に、ロードしてリセットをクリックします。スクリプトを手動で実行するには、ビューポート内の顕微鏡オプティブバーをLSMに設定します。これにより、画像がアライメント済みの光学系にあるDMDを介して送信されます。そして、暗視野画像がCascade five 12カメラのCCDに投影されます。IP labのライブプレビューにダークフィールド像が表示されている必要があります。必要に応じて、ライブプレビューで像のフォーカスを調整してください。画像内の信号強度が少なくとも10,000カウントになるように、露出時間を十分に長く設定します。次に、「acquire single」コマンドを使用して、視野のスナップショットを撮影します。「save as indexed」コマンドを使用して、画像をディスクに保存してください。GTIの画像によって視野のサイズを測定します。次に、GTIサンプルを視野外に移動させ、背景のみが見える状態にします。少なくとも5,000カウントを取得するのに十分な露光時間で、その視野の背景画像をキャプチャします。この画像は、フィルター未処理の画像の背景減算に利用されます。次に、背景のガボールフィルタ処理画像を収集するため、ガボールフィルタバンク（Gabor Filter Bank）スクリプトをDMD制御ソフトウェアにロードします。スクリプト全体を実行し、フィルタをDMDのオンボードメモリにバッファリングしてください。スクリプト全体のバッファリングが完了するまで、数分かかる場合があります。DMDソフトウェア内のスタートおよびストップマーカーを使用し、1つのGabor Likeフィルターに対応するフィルターセットが一度に1組だけ読み込まれるようにしてください。スクリプトを実行して、背景のフィルタリング画像を収集します。ライブ画像プレビューがダークフィールドからフィルタリング画像に切り替わります。そのフィルターについて、ディスクからIP labで取得スクリプトを開きます。少なくとも2000カウントが取得されるように、露光時間を調整してください。DMDスクリプトが動作している間に、IP labのライブプレビューをキャンセルし、取得スクリプトを実行します。これにより、自動的にインデックスを取得し、フィルタリングされた画像がディスクに保存されます。最初の画像が取得されたら、DMDで実行中のスクリプトを停止してください。その後、使用したコマンドをスクリプトから削除してください。次に、次のフィルターセットの開始および終了マーカーを置き換えます。フィルターバンクをすべて使い切り、すべてのフィルタリング済み画像を取得して保存するまで、IPラボで取得を繰り返します。ラボベンチにハンダごてを接続し、L 15培地を37 °Cに加熱して、細胞の播種準備をしてください。ペーパータオルとKimwipeを用意してワークステーションを構築し、こぼれた培地を吸収させ、作業領域を清潔に保ちます。Kimwipeをちぎって丸めることで、芯（ウィック）を数本作成します。これらの芯は、セルプレートから液体を吸い出すために使用します。次に、金属製サンプルホルダーを使用してセルサンドイッチを作成します。シリンジを用いて、加工済み金属プレートの穴の上部外周に沿って真空グリースを薄く塗布し、両側の溝の端の約半分まで伸ばします。きれいな1番カバーガラスを、グリースの上の位置に静かに載せます。プレートを裏返し、穴の周囲にグリースを塗布します。エタノールで滅菌したNIトライアル試験用手袋を着用し、室内の照明を消します。インキュベーターから細胞を取り出します。実験に使用するカバーガラスを6ウェルプレートから取り出します。カバーガラスを慎重に乾燥させます。次に、観察孔上のグリースを塗布した金属プレートに、カバーガラスのセル側を下にして押し込みます。プレート内で細胞を挟み込みます。気泡が残っていないこと、および培地を充填できるようにグリースで水密シールが形成されていることを確認してください。次にプレートを元に戻し、一度に200 µLずつピペッティングします。あらかじめ温めておいたL 15培地を、上部カバーガラスと金属プレートの間の溝を通して、液面が反対側の溝に届くまでサンドイッチ状の構造体の中に加えます。次に、反対側の溝にウィック（吸水材）を当て、さらに200 µLの培地をピペットでサンドイッチ状の構造体に注入して、細胞を洗浄します。ウィックによって古い培地が除去されることで、培地が一方の側からもう一方の側へと流れます。このステップでは、液体の中に気泡が形成されないよう注意してください。洗浄ごとに新しい芯を使用して、この工程を2〜3回繰り返します。次に、プレートの端を支えながら、もう一度プレートを反転させ、リザーバー内に液体を閉じ込めます。はんだごてをveapが入ったビーカーに浸し、veapの一部を素早く溶かして、はんだごての先端に付着させます。はんだごての先端を用いて、溶けたveapをカバースリップ底面の縁に沿って慎重に塗布します。カバースリップの周囲全体に浸漬と塗布を繰り返し、金属プレートに封止します。これにより良好な機械的シールが形成され、観察中にカバーガラスがプレートから剥がれるのを防ぎます。Kimwipeを丸めてカバーガラスの表面を拭き、底面の残留物を除去してください。カバーガラスの中央部、すなわち観察領域が最も清潔に保たれるよう、一度のスライド動作で滑り込ませます。6ウェルプレートをインキュベーターに戻します。プレートに入れた細胞を光学室に運び、対物レンズ上にマウントします。前と同様に、健康そうな細胞が見える視野を探し、その視野の暗視野像を撮影します。次に、顕微鏡をDICに合わせ、露光時間が適切であることを確認してください。その後、カスケードカメラを用いてDIC像を撮影します。このセットアップでは、顕微鏡をDIC（微分干渉）で調整したまま、cool SNAPカメラを用いて蛍光画像を取得します。顕微鏡のVARを1倍に設定し、ビューポートを100%双眼に設定して、接眼レンズからカメラへ画像を転送します。コンデンサーの上に青色LEDを配置して、視野を照明します。次に、RSS画像で視野を確認し、微焦点調整を行います。必要に応じてDIC画像を取得し、ディスクに保存します。この視野が、カスケードカメラで得られた視野とどのように異なるかを確認してください。これらの画像は、実験の解析段階でレジストレーション（位置合わせ）を行う必要があります。次に、蛍光フィルターキューブを所定の位置に移動し、顕微鏡シャッターを用いて短時間だけ蛍光励起を行い、蛍光画像を取得します。取得が完了したら、すぐにシャッターを閉じます。光退色を最小限に抑えるため、蛍光画像はディスクに保存してください。フィルター処理後の画像を撮影するために、顕微鏡を視野にリセットし、光をLSMポートに送ります。 l前と同様に、細胞がステージ上にあり、かつ視野を乱さない状態で、Gaborフィルターバンクスクリプト全体を実行して、ある一時点のデータ収集を完了させてください。ウィッキング法を用いて、通常のL 15培地を、1 µMのSTS溶液を含む同培地に入れ替えます。実験の過程で、乾燥を防ぐために追加の培地を補充します。セルプレートをステージから外したり、視野を乱したりすることなく、ピペットでプレートの溝に培地を注入してください。次に、実験が完了するまで、以降の時間点についてこれらの手順を繰り返します。収集したデータには大量のフィルタリング済み画像が含まれており、細胞内構造データを抽出するための処理が必要となります。ここでは2つの例示的な実験を示します。この図は、海洋ダイアトム藻類のサンプルの連続画像です。配向した特徴がはっきりと確認できます。暗視野イメージングにおいて。5=0度から5=160度までラベル付けされた光学フィルタ処理後の画像が、サンプルのフィルタ未処理画像と並べて表示されています。比較のため、珪藻の9枚のガボールフィルタ処理画像のセットを、物体の方向についてピクセル単位で処理しました。各ピクセルにおいて、フィルターの配向方向の関数として、最大信号を平均信号で除し、アスペクト比の値を算出しました。ここで、青色で示される1に近いアスペクト比は、優先的な応答角度が存在しない領域を示しています。赤色で示されるより大きな値は、より高い優先応答角度が存在する領域を示しています。合計GABORフィルター応答の輝度とコードの有意性は、フィルターの配向を示しており、各ピクセルで最大信号が得られる方向は、基礎となるオブジェクトの配向に対して垂直な方向に対応します。サブストラクチャ粒子の配向はクィバープロットでエンコードされており、各ラインは、フィルター未処理のダークフィールドで可視化された基礎的な局所オブジェクトの配向と密接に一致しています。このクィバープロットは、応答強度が最大値の10%を超えるオブジェクトの配向を示しています。これらは、生存しているウシ内皮細胞を含む視野の暗視野および光学フィルタ画像であり、アポトーシス誘導剤であるstaurosporineで処理した後、3時間にわたって20分ごとにフィルタ画像を取得しました。ここでは、上段のパネルにアスペクト比マップを、下段のパネルにミトコンドリアの蛍光画像を、時間の関数として示しています。色調は配向度を表しており、これらの時間プロットは、staurosporineで処理した内皮細胞における粒子アスペクト比の配向度の低下を比較したものです。個々のトレースは、単一細胞内での時間プロットを表しています。ドロップインの配向性は、蛍光領域と一致する細胞領域に限定されています。これで、蛍光による検証が完了しました。これにより、アーカイブ化されます。したがって、次以降の実験では、蛍光イメージングの手順を省略し、光散乱法を直接用いることでミトコンドリアの測定が可能です。ここでは、Gaborフィルターに基づく光散乱シグネチャを用いて、アポトーシス中のミトコンドリア断片化をモニタリングする方法を説明しました。この手順を行う際は、適切なライフスタイル準備を行い、光学系の光軸調整と校正が適切に完了していることを確認することが重要です。それでは、UI実験での観察とCoLabの活用について考えていきましょう。

optical-scatter-microscopy-based-on-two-dimensional-gabor-filters

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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生物材料からの空間的及び道順変化する光散乱の測定

我々は前にマンモグラムの建築の歪みを検出する方法を示しています。配向構造は、組織パターンを照射する部位を検出するために、ガボールフィルタと位相の肖像画を用いて分析する。各サイトには特徴づけられ、spiculatingパターンを表現するための措置を使用して分類されている。方法は、乳癌の検出を支援すべきである。...

前にマンモグラムにおける構造的ひずみを検出経由分析

弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています。...

弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）

この記事は、全反射蛍光照明(TIRF-SIM)で動作する構造化照明顕微鏡の組み立てと操作のための詳細なガイドを提供します。これにより、複数の色の光学超解像でダイナミックな生物学的プロセスをイメージングすることができます。...

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

非撹拌沈殿重合は、狭いサイズ分布の刺激応答性ポリ（N -isopropylacrylamide）ミクロゲルの合成への迅速な、再現性のプロトタイピング手法を提供します。このプロトコル合成では、光散乱特性評価および広視野顕微鏡のセットアップでこれらのミクロゲルの単一粒子蛍光追跡が実証されています。...

制御された合成および均一性の高いポリの蛍光トラッキング（<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide）ミクロゲル

このプロトコルは、ゴニオフォトメーター原理を用いて眼内レンズ（IOL）からの光の前方散乱および後方散乱の全角度定量評価を可能にする走査光散乱プロファイラー（SLSP）について記載している。...

眼内レンズからの前方散乱光および後方散乱光を定量的に評価するための走査型光散乱プロファイラ（SLPS）に基づく方法論

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM...

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

ターゲット細胞表面受容体に結合する抗体は、コンフォメーションとクラスタ リングの変化を与えることができます。これらの動的な変更には、標的細胞で医薬品開発を特徴付けるための含意があります。このプロトコルは、共焦点顕微鏡、細胞表面の受容体の程度を定量化する...

共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集

ここでは、新規イメージングのマルチ モーダルなプラットフォームを使用して大規模な視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光と OCT 網膜像を取得するためのプロトコルを提案する.システム セットアップ、配置の方法と運用のプロトコルを紹介します。In...

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本プロトコルでは、概念設計要素とグレア視力装置の構造開発の概要を説明する。さらに、正のジフォトプシア(ハロー、スポーク)および2点光閾値を測定するための装置の設計について説明する。...

眼内散乱の行動効果の測定

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二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡

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