Name: 二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-02T17:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 学ぶ二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡法で、アポトーシス時のミトコンドリア断片化を定量化する手法。この非侵襲的技術は細胞内オルガネラ動態をリアルタイムで評価し、蛍光標識不要で構造変化を検出できる。

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この研究ではマイクロミラーデバイスはN Boustanyにウィテカー財団の助成金RG - 02から0682によって賄われていた。進行中の作業は、N. Boustanyに助成NSF - DBI - 0852857によって運営されている。 RMパスターナックは、部分的にラトガース大統領大学院フェローシップによってサポートされていました。我々はまた、光のフィルタリング戦略に関する有用な議論のための我々の研究と博士DNのメタクサスで使用されているiBMK細胞のために博士E.ホワイトに感謝したいと思います。

<ol><li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., White, E., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Subcellular+Texture+by+Optical+Gabor-Like+Filtering+with+a+Digitial+Micromirror+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Measurement of Subcellular Texture by Optical Gabor-Like Filtering with a Digitial Micromirror Device.</a> Optics Letters. 33 (19), 2209-2211 (2008).</li>
<li>Pasternack, R. M., Qian, Z., Zheng, J. -Y., Metaxas, D. N., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+size+discrimination+of+submicron+objects+using+optical+Fourier+filtering+based+on+two-dimensional+Gabor+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive size discrimination of submicron objects using optical Fourier filtering based on two-dimensional Gabor filters.</a> Optics Express. 17 (14), 12001-12012 (2009).</li>
<li>Zheng, J. -Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+scatter+imaging+with+a+digital+micromirror+device%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical scatter imaging with a digital micromirror device.</a> Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).</li>
</ol>

方法のいくつかの側面がで、発明の開示、ラトガース大学ドケット＃09から049まで含まれています。

方法は、例えば、粒子のサイズや向きをコード化することができるオブジェクトの収量形態学的地図上に記載。この構造情報は、いくつかの方法で使用することができます。 <ol><li>それは特定の治療中に変更され、さらに特定の分子と生化学的アッセイでこれらの領域を分析are組織または細胞領域を識別するために、初期画面として使用することができます。 </li><li>それは、細胞内構造体（この方法による）の定量的特性を持つ分子の活性を同時に理解する（蛍光による）を結合した​​細胞のマルチモーダル歩留まり解析する蛍光と組み合わせて使用​​することができます。 </li><li>特定の構造物の応答が特定の生物学的プロセス（例えばアポトーシス）の特定のオルガネラ活性と相関されると、メソッドはこの構造応答に影響を与えるさまざまな遺伝的および実験条件のための画面への蛍光ラベルすることなく使用することができます。 </li></ol>これまでに我々は、メソッドが30 - 50nmの[2]オーダーの粒径の違いに敏感であることが示されている。我々は、メソッドが粒子の配向とアスペクト比の変化に敏感であることが示...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>低グルコースDMEM</td></tr><tr><td>Liebowitz L15培地</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>フェノールレッド不含</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ脳抽出物</td><td>Clonetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スタウロスポリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>DMD</td><td>Texas Instruments</td><td>TI 0.7 XGA DMD 1100</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Cascase 512B</td><td>高（16ビット）ダイナミックレンジCCD</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Roper Scientific</td><td>Coolsnap cf</td><td></td></tr></tbody></table>

二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡

Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

我々は、染色生細胞内で細胞小器官の形態と組織に起因する細胞内のテクスチャを測定することができる微細な楽器を示しています。提案された楽器は、オルガネラのサイズと形状のナノスケールの変化にラベルフリーの光学顕微鏡の感度を拡張し、そのようなプログラム細胞死や細胞のような基本的な生物学的プロセスを、根底にあるオルガネラダイナミクスに関する構造機能相関の研究を加速するために使用することができます。分化。顕微鏡は簡単に既存の顕微鏡のプラットフォーム上で実装することができますので、科学者が無制限にアクセスできる提案手法を実装して使用できる個々の研究室、に普及することができます。 提案手法は、2次元光ガボールフィルタを介して細胞を観察することによって、細胞下構造を特徴づけることができます。これらのフィルタは、ナノスケール（10のnmの）感度、非球状細胞内小器官の大きさや向きに関係する特定の形態学的属性と意味するように調整することができます。弾性散乱によって生成されたコントラストに基づいて、一方で、技術は、形態学的測定値を抽出する詳細な逆散乱モデル上または三重理論に依存しません。この手法は、したがって、正確な理論的なスキャッタ記述が容易に与えされていない非球面小器官に適用可能であり、その機能を評価するために染色生細胞内で取得することができる独特の形態学的パラメータが用意されています。テクニックは、離散物体の強度ではなく、変換するオブジェクトのフィールドを直接操作するという点でデジタル画像処理に比べて有利である。それは、高い画像のサンプリングレートに依存しないため、このように非常に高倍率デジタル画像の蛍光共焦点顕微鏡による個々のオルガネラのセグメンテーションと再構築を超えて細胞小器官の構造の研究を促進、急速に一度に細胞の数百の中で形態学的活性をスクリーニングするために使用することができます。ビューの限られたフィールドの。 このデモでは、方法論を説明するために海洋性珪藻からのデータを示す。我々はまた、メソッドが関連する生物学的な文脈に適用する方法のアイデアを与えるために生きている細胞から収集された予備的なデータを示しています。

我々は、単一の生細胞内で細胞内動態を測定するためのフィルタリングガボールのように基づいて、暗視野顕微鏡法を示しています。技術は、ミトコンドリアの断片化などの細胞小器官の構造の変化に敏感です。

私たちは、未染色の生細胞内におけるオルガネラの形態および組織化に起因するサブセルラーテクスチャ（細胞内微細構造）を測定できる顕微鏡装置を提示します。

このビデオでは、光学散乱顕微鏡を用いて、アポトーシス中のミトコンドリア断片化を定量化します。本プロトコルにおいて、光学散乱顕微鏡は通常蛍光を必要としませんが、検証目的で蛍光画像を取得します。イメージングシステムのセットアップ後、細胞をMIT tracker greenで標識し、staurosporinで処理してアポトーシスを誘導します。2時間以内に細胞小器官の配向の変化を検出するために、光学データを取得します。ミトコンドリア断片化の開始は、細胞内粒子の配向度の低下を示す光学散乱データを用いて測定できます。その後、光学散乱データとミトコンドリアを含む蛍光領域を相関させることで、データの検証を行います。こんにちは。ラトガース大学生物医学工学科、バイオオプティクス研究室のナダ・ブスタニです。同じくバイオオプティクス研究室のロブ・パックです。そして、同じくバイオ研究室のディーンです。本日は、蛍光染料に依存しない手法を用いて、細胞内小器官の形態学的ダイナミクスを定量化する手順についてご紹介します。当研究室では、アポトーシス（プログラム細胞死）における細胞内構造の動的な変化を研究するために、この手法を用いています。それでは、手順を開始しましょう。まず、手袋を着用した手を70% ethanolで滅菌します。次に、調製した100 nMのMitoTracker Greenストック溶液と、あらかじめ温めておいたBAEC細胞培養培地を、消灯したフード内に設置し、すべての表面を滅菌します。続いて、カバーガラス上に細胞を播種した6ウェル培養皿をフード内に設置します。真空ラインに接続されたペーストピペットを使用してください。ウェルから細胞培地を除去します。次に、細胞（ミトコンドリア）を標識するため、各ウェルに標識培地を2 mLずつ直ちに追加します。室内の直射光にさらされないよう組織培養プレートにカバーをかけ、速やかに細胞をインキュベーターに戻します。細胞を37°Cで45分間インキュベートします。その間に光学系のセットアップを行い、まず水銀アークランプを点灯させます。次に、コンピューター、顕微鏡カメラ、およびレーザーを起動し、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）をスピニングディフューザーに装着します。次に、顕微鏡の接眼レンズを覗き、光学的な導入（ launched）が調整されているかを確認します。視野がレーザー光で明るく照らされているはずです。サンプルをロードするには、63 x 油浸対物レンズを完全に下げた状態で、レンズの上に浸漬油を1〜2滴落とします。次に、gradiと呼ばれる10 µm間隔の格子線が描かれたスライドをステージに設置し、対物レンズを上げてオイルでピントを合わせます。次に、コンデンサー視野の六角形の縁に焦点を合わせます。中央ケーラー照明に調整されるまで操作を停止してく

optical-scatter-microscopy-based-on-two-dimensional-gabor-filters

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:エスピノーザ、R.、他.組織診断のためのマウス脳のリアルタイム2色刺激ラマン散乱イメージング. J. Vis. Exp.

マウス脳組織の2色刺激ラマン散乱イメージング

私たちは、構造的に複雑な材料からの散乱光の方向に空間的な変化をサンプリングするための非破壊的手法を提案する。同時に高分解能イメージングの微細スケールの方向の貢献を取り込む際に材料をそのまま維持することによって、我々は、総規模散乱挙動を保つ。結果は、生体関連ポジションとスケールでソフトウェアで可視化する。...

生物材料からの空間的及び道順変化する光散乱の測定

我々は前にマンモグラムの建築の歪みを検出する方法を示しています。配向構造は、組織パターンを照射する部位を検出するために、ガボールフィルタと位相の肖像画を用いて分析する。各サイトには特徴づけられ、spiculatingパターンを表現するための措置を使用して分類されている。方法は、乳癌の検出を支援すべきである。...

前にマンモグラムにおける構造的ひずみを検出経由分析

弱散乱物体の三次元位置が一意的に標準的な顕微鏡に軽微な改変を伴うデジタルインラインホログラフィック顕微鏡法（DIHM）を用いて同定することができる。当社のソフトウェアは、微細な位相物体の3次元位置と形状を得るためにレイリー·ゾンマーフェルトバックプロパゲーションと相まって、簡単な画像処理、ヒューリスティックを使用しています。...

弱散乱被験者のデジタルインラインホログラフィ顕微鏡（DIHM）

私たちは、明視野と微分干渉コントラスト画像の組み合わせを通じて、細胞の質量、体積、密度の定量的測定を行うための標準的な光学顕微鏡の使用について説明します。...

定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

非撹拌沈殿重合は、狭いサイズ分布の刺激応答性ポリ（N -isopropylacrylamide）ミクロゲルの合成への迅速な、再現性のプロトタイピング手法を提供します。このプロトコル合成では、光散乱特性評価および広視野顕微鏡のセットアップでこれらのミクロゲルの単一粒子蛍光追跡が実証されています。...

制御された合成および均一性の高いポリの蛍光トラッキング（<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide）ミクロゲル

このプロトコールは、超高速マイクロ流体流における単一細胞イメージングのための非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡検査システムの実施およびイメージングフローサイトメトリーにおけるその応用を記載する。...

非対称検出時間ストレッチ光学顕微鏡（ATOM）によるマイクロ流体イメージングフローサイトメトリー

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM...

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

ターゲット細胞表面受容体に結合する抗体は、コンフォメーションとクラスタ リングの変化を与えることができます。これらの動的な変更には、標的細胞で医薬品開発を特徴付けるための含意があります。このプロトコルは、共焦点顕微鏡、細胞表面の受容体の程度を定量化する...

共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集

本プロトコルでは、概念設計要素とグレア視力装置の構造開発の概要を説明する。さらに、正のジフォトプシア(ハロー、スポーク)および2点光閾値を測定するための装置の設計について説明する。...

眼内散乱の行動効果の測定

本稿では、広視野蛍光顕微鏡を用いた移動式単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)ベースのプローブの時空間解析方法を紹介する。新開発のソフトウェアツールキットは、正しいFRET効率や分子位置を含む移動プローブのsmFRET時間トレースを時間の関数として決定することを可能にします。...

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

学ぶ二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡法で、アポトーシス時のミトコンドリア断片化を定量化する手法。この非侵襲的技術は細胞内オルガネラ動態をリアルタイムで評価し、蛍光標識不要で構造変化を検出できる。

二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡

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