二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡
2010年6月2日
我々は、単一の生細胞内で細胞内動態を測定するためのフィルタリングガボールのように基づいて、暗視野顕微鏡法を示しています。技術は、ミトコンドリアの断片化などの細胞小器官の構造の変化に敏感です。
このビデオでは、光散乱顕微鏡を使用して、アポトーシス中のミトコンドリアの断片化を定量化します。光学散乱顕微鏡法は通常、このプロトコルで蛍光を必要としませんが、蛍光画像は検証目的で取得されます。イメージングシステムのセットアップ後、細胞をMITトラッカーグリーンで標識し、ストースポリンで処理してアポトーシスを誘導します。
光学データを取得して、細胞小器官の向きの変化を2時間以内に検出します。ミトコンドリアの断片化の始まりは、細胞内粒子の配向度の低下を示す光散乱データを使用して測定できます。次に、光学散乱データをミトコンドリアを含む蛍光領域と相関させることにより、データを検証します。
こんにちは、ラトガース大学医用生体工学科の生物光学研究所のナダ・ブスターニです。私はバイオオプティクスラボのロブ・パック、そして同じくバイオラボのディーンです。今日は、蛍光色素に依存しない方法を使用して細胞内形態学的ダイナミクスを定量化する手順を紹介します。
私たちの研究室では、この技術を用いて、アポトーシスやプログラム細胞死時の細胞内構造のダイナミックな変化を研究しています。それでは始めましょう。この手順は、手袋をはめた手を70%エタノールで滅菌することから始めます。
次に、Miot Tracker Greenの調製した100ナノモルストック溶液を、ライトをオフにしてフードに温めたBAEC細胞培養培地に入れ、すべての表面を滅菌します。次に、フードの下のカバーガラスに細胞をメッキした6ウェル培養皿を置きます。バキュームラインに接続されたペーストピペットを使用します。
ウェルから細胞培地を取り出します。次に、すぐに2ミリリットルの標識培地を各ウェルに加えて、細胞を標識します。ミトコンドリア。組織の培養プレートを覆って、室内の直射日光にさらされないようにし、細胞をインキュベーターにすばやく戻します。
細胞がインキュベートしている間、摂氏37度で45分間インキュベートします。光学セットアップを準備し、最初に水銀アークclをオンにしますamp.次に、コンピューター顕微鏡カメラの電源を入れ、デジタルマイクロミラーデバイスまたは回転ディフューザーのDMDをレーザープラグします。
次に、顕微鏡の接眼レンズを覗いて、光学発射が位置合わせされているかどうかを確認します。視野はレーザー光で明るく照らされている必要があります。サンプルをロードするには、63 x オイル浸漬対物レンズを 1 〜 2 滴の液浸オイルに 1 〜 2 滴垂
らします。次に、ステージ上にグラディと呼ばれる10マイクロメートル間隔の線のグリッドで構成されるスライドを取り付け、オイルが焦点を合わせるように対物レンズを持ち上げます。次に、コンデンサーフィールドの六角形のエッジに焦点を合わせます。中央のコーラー照明に揃うように停止します。
六角形のエッジは接眼レンズの中央にあり、鋭く焦点が合っている必要があります。次に、コンデンサーフィールドの停止位置ノブの中央、コンデンサーフィールドを使用して、視野上で停止します。IPラボを起動し、カメラを操作するための設定を入力します。
カメラがフレーム転送モードに設定されていることを確認します。acquire focus コマンドを実行して、ライブ プレビューを開始します。次に、インデックスのプレフィックスと、画像を保存するファイルの場所を設定します。
次に、RSイメージを開始します。クールスナップカメラを操作するための設定を指定します。クロッキング モードは normal に設定する必要があります。
DMDソフトウェアを起動します。暗視野の虹彩をスクリプトメニューに配置します。次に、[ロードしてリセット]をクリックします。
スクリプトを手動で実行するには、ビューポートの顕微鏡のオプティブバーをLSMに設定します。これにより、アライメントされた光学系のDMDを介して画像が送信されます。Cascade five 12カメラのCCDに暗視野画像を投影します。
暗視野画像は、IPラボのライブプレビューに表示されます。必要に応じて、ライブプレビューに画像の焦点を合わせます。画像内の信号が少なくとも 10, 000 カウントになるように、露出時間を十分に高く設定します。
次に、取得後に acquire single コマンドを使用して視野のスナップショットを撮ります。「インデックスとして保存」コマンドを使用して、イメージをディスクに保存します。GTIの画像は、視野のサイズを測定します。
次に、GTI サンプルを移動して、視野を越え、背景のみが表示されるようにします。少なくとも5, 000カウントを取得するのに十分な露光時間でフィールドの背景画像をキャプチャします。この画像は、フィルタリングされていない画像の背景の減算に役立ちます。
次に、背景のGaborフィルタリング画像を取得するには、GaborフィルターバンクスクリプトをDMD制御ソフトウェアにロードします。スクリプト全体を実行して、フィルターを DMD のオンボード メモリにバッファーします。スクリプト全体がバッファリングされると、これには数分かかる場合があります。
DMDソフトウェア内のスタートマーカーとストップマーカーを使用して、一度に1つのGabor Likeフィルターに対応するフィルターのセットが1つだけロードされるようにします。スクリプトを実行して、背景のフィルタリングされた画像を取得します。ライブ画像のプレビューが暗視野からフィルタリングされた画像に変わります。
そのフィルタについては、ディスクからIPラボで取得スクリプトを開きます。露出時間を調整して、少なくとも2000カウントが取得されるようにします。DMD スクリプトの実行中に、IP ラボでのライブ プレビューをキャンセルし、集録スクリプトを実行します。
これにより、フィルタリングされた画像が自動的にインデックスを取得し、ディスクに保存されます。最初の画像が取得されたら、DMD で実行されているスクリプトを停止します。使用したコマンドをスクリプトから削除します。
次に、次のフィルターセットの先頭と末尾の開始マーカーと停止マーカーを置き換えます。フィルターバンク全体を使用し、フィルタリングされたすべての画像を取得して保存するまで、IPラボで取得を繰り返します。ラボのベンチトップにはんだごてを差し込み、L 15培地を摂氏37度に加熱して、セルを播種する準備をします。
ペーパータオルとキムワイプを備えたワークステーションを作成して、こぼれた媒体を吸収し、領域を清潔に保ちます。キムワイプを引き裂いて回転させて、いくつかの芯を準備します。芯は、細胞プレートを通して液体を引き込むために使用されます。
次に、金属製のサンプルホルダーを使用してセルサンドイッチを作成します。シリンジを使用して、機械加工された金属板の穴の上部の周囲に真空グリースの薄いビーズを塗布し、両側の溝の端まで約半分伸びます。きれいなナンバーワンカバースリップをグリースにそっと渡します。
プレートを裏返し、穴の周りにグリースを塗ります。エタノール滅菌NI試験用手袋を着用して、部屋の照明を消してください。インキュベーターから細胞を取り出します。
実験に使用するカバースリップを6ウェルプレートから取り外します。カバースリップを丁寧に乾かします。次に、カバースリップセルを下にして、グリースを塗った金属プレートに押し込みます view穴の上の。
プレート内に細胞を挟みます。エアギャップが残っていないこと、およびグリースが水密シールを形成して媒体を装填できることを確認してください。次に、プレートを裏返して、一度に200マイクロリットルをピペッティングします。
プレウォームL15メディウムを、アッパーカバースリップと金属プレートの間の溝からサンドイッチに加え、液体が反対側の溝にほぼ到達するまで加えます。次に、反対側の溝に芯を保持し、さらに200マイクロリットルの培地をサンドイッチにピペッティングして細胞を洗浄します。芯が古い媒体を取り除くと、媒体は一方の側からもう一方の側に流れます。
このステップ中に液体内に気泡が形成されないように注意してください。すすぎのたびに新しい芯を使用して、このプロセスを2〜3回繰り返します。次に、プレートを端から支えてプレートをもう一度反転させ、セルリザーバーに液体を閉じ込めます。
はんだごてをビーカーに浸して、ビープの一部をすばやく溶かし、はんだごての先端にくっつきます。はんだごての先端を使用して、底カバースリップの端に脱皮ビープを慎重に塗布します。カバースリップの周囲を浸して塗布し続け、金属板に密封します。
これにより、優れたメカニカルシールが作成され、見ているときにカバースリップがプレートから外れることはありません。底から残留物を取り除きます。キムワイプを鳴らしてカバーを掃除して、滑り面を覆います。
1回のスライド動作で滑り込ませて、カバースリップが見える中央で最もきれいになるようにします。6つの壁のプレートをインキュベーターに戻します。めっきしたセルを光学ラボに持って行き、対物レンズに取り付けます。
前回と同様に、健康そうな細胞のフィールドを見つけ、視野の暗視野画像を取得します。次に、顕微鏡をDICに合わせ、露光時間が適切であることを確認します。カスケードカメラでDIC画像を取得します。
このセットアップでは、顕微鏡をDICに位置合わせしたまま、クールSNAPカメラを使用して蛍光画像を取得します。顕微鏡のVARを1 xに、ビューポートを100%双眼に設定し、画像を接眼レンズからカメラにそらします。コンデンサーの上に青色のLEDを配置して、フィールドを照らします。
次に、RSS画像で視野をプレビューし、ファインフォーカスを調整します。必要に応じて、DICイメージを取得し、ディスクに保存してください。視野がカスケード カメラから取得した視野とどのように異なるかに注意してください。
これらの画像は、実験の分析段階で登録する必要があります。次に、蛍光フィルターキューブを所定の位置に移動させ、顕微鏡シャッターを使用して蛍光励起を短時間オンにして蛍光画像を取得し、取得が完了したらすぐにオフにします。光退色を最小限に抑えるには、蛍光画像をディスクに保存します。
フィルタリングされた画像を取得するには、顕微鏡をフィールドにリセットし、LSMポートを介して光を送信します。前回と同様に、前と同じようにGaborフィルタバンクスクリプト全体を実行して、セルがまだステージ上にある間に、視野を乱すことなく、1つの時点のデータ取得を完了します。ウィッキング法を使用して、通常のL 15培地をSTSの1マイクロモル溶液を含むものと交換します。
実験の過程で、培地をステージから取り除いたり視野を乱したりすることなく、培地を細胞プレートの溝にピペッティングして乾燥を防ぐために、追加の培地を追加します。次に、実験が完了するまで、後続の時点に対してこれらの手順を繰り返します。収集されるデータには、細胞内構造データを抽出するために処理する必要がある多数のフィルタリングされた画像が含まれます。
ここでは、2 つの実験例を示します。この図は、海産珪藻藻類のサンプルの連続画像を示しています。指向性の特徴がはっきりと見えます。
暗視野イメージング。5が0度に等しいから5が160度に等しいとラベル付けされた光学的にフィルタリングされた画像は、サンプルのフィルタリングされていない画像と一緒に表示されます。比較のために、珪藻の9つのGaborフィルタリング画像のセットを、オブジェクトの向きについてピクセルごとに処理しました。
各ピクセルで、最大信号を平均信号で割って、フィルターの向きの関数としてアスペクト比の値を求めました。ここで、青色で示されるものに近いアスペクト比は、好ましい応答角度がない領域に存在します。赤で示される値が大きいほど、より高い優先角度応答が存在する領域を示します。
GABORフィルタの全応答の明るさとコードの重要性、フィルタの向き、各ピクセルで最大信号を与えることは、基礎となるオブジェクトの向きに垂直な方向に対応します。サブストラクチャーの粒子配向は、各線がフィルタリングされていない暗視野で見える基礎となる局所的な物体の向きと密接に一致する矢筒プロットにエンコードされます。quiverプロットは、応答強度が最大値の10%を超えるオブジェクトの向きを示しています。
これらの暗視野および光学的にフィルタリングされた視野の画像は、生きたウシ内皮細胞を含んでおり、続いて、アポトーシス誘導剤stor sporinによる処理後3時間にわたって20分ごとにフィルタリングされた画像が取得された。ここでは、上段のアスペクト比マップと下段のミトコンドリアの蛍光イメージングを時間の関数として示しています。これらの時間プロットが、sトロスポリンで処理された内皮細胞における粒子のアスペクト比の配向度の減少を比較する前に、個々のトレースが単一細胞内の時間プロットを表す前に、色相は配向の程度を表す。
ドロップイン指向性は、蛍光領域に登録される細胞の領域に限定されます。今回、蛍光に対する検証が達成されました。アーカイブになります。
したがって、次の実験では、蛍光イメージングステップを省略し、光散乱法を直接使用することで、ミトコンドリアの測定を行うことができます。アポトーシス中のミトコンドリアの断片化を、Gaborフィルターに基づく光散乱シグネチャーを使用してモニタリングする方法を紹介しました。この手順を行うときは、ライフスタイルの準備をしっかりと行い、光学セットアップが適切に調整され、校正されていることを確認することが重要です。
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概要
本研究では、Gaborライクフィルタリングを利用して生存細胞内の細胞内ダイナミクスを評価する暗視野顕微鏡法を提示します。この手法は、アポトーシス中のミトコンドリア断片化など、オルガネラ構造の変化に対して特に高い感度を示します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 顕微鏡技術
背景
- ミトコンドリアの断片化は、アポトーシスの重要な指標です。
- 従来の顕微鏡法では蛍光が必要な場合が多く、適用範囲が制限されていました。
- 光散乱顕微鏡は、非侵襲的な代替手段を提供します。
- オルガネラのダイナミクスを理解することは、細胞の健康状態に関する知見を得るために不可欠です。
研究目的
- 光散乱顕微鏡を用いてミトコンドリアの断片化を定量化すること。
- 蛍光イメージング技術を用いて光学データを検証すること。
- アポトーシス時における細胞内小器官のダイナミクスへの理解を深めること。
使用した手法
- MIT tracker greenで標識した細胞。
- アポトーシスを誘導するためのstaurosporine処理。
- オルガネラの配向をモニタリングするための光学データの取得。
- 検証のための光学データと蛍光画像の相関分析。
主な結果
- 光学散乱顕微鏡は、ミトコンドリアの断片化を効果的に検出します。
- データは、細胞内粒子の配向性の低下を示しています。
- 蛍光による検証により、光学測定の正確性が確認されました。
- 本手法は、アポトーシス時における細胞小器官のダイナミクスに関する知見を提供します。
結論
- Gabor風フィルタリング法により、暗視野顕微鏡の感度が向上します。
- この手法は、さまざまな細胞プロセスの研究に適用可能です。
- ミトコンドリアダイナミクスの理解は、治療戦略の開発において不可欠です。
よくあるご質問
産業界における重要性
2次元ガボールフィルタを用いた光学散乱顕微鏡法により、アポトーシス中のミトコンドリア断片化などの細胞内構造ダイナミクスのラベルフリー定量化が可能となり、生細胞におけるオルガネラの形態と機能を非侵襲的に評価する手法が提供されます。このアプローチは、蛍光ラベルや複雑な逆散乱モデルに依存することなく、機能的結果と相関する細胞内変化の定量的で再現性のあるリードアウトを提供するため、初期探索段階におけるターゲット検証およびメカニズムのデリスキングを支援します。本技術は既存の顕微鏡プラットフォームとの互換性があり、迅速なスクリーニングが可能なため、探索から前臨床研究へのトランスレーショナルな連続性が促進され、パスウェイ調節や化合物スクリーニングにおける予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：細胞内ストレスまたは死の経路の機能的リードアウトとして、オルガネラの配向変化を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：ラベルフリーで生細胞に適応した測定を提供し、実験的なばらつきを低減させ、再現性のあるターゲットエンゲージメント評価を支援する。
- 予測的価値：相関可能な光学的シグネチャを通じて、化合物誘導性の形態変化をアポトーシスの進行に結びつけることで、メカニズム的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： Gaborフィルタ処理を施した画像から定量的なアスペクト比マップを生成し、化合物スクリーニングのための客観的かつハイコンテンツな形態学的パラメータとして利用できる。
- 運用の価値： 高いサンプリングレートを必要とせずに、数百個の細胞にわたるフィルタ処理済み画像を迅速に取得でき、拡張性のあるアッセイ形式をサポートする。
- アッセイへの適用性： 出力はオブジェクトのフィールド変換から直接導出されるため、離散化によるアーティファクトを回避し、一貫性のあるラベルフリーな形態学的プロファイリングを可能にする。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：光学散乱データと蛍光検証を相関させることで、モデルシステム全般に適用可能なオルガネラダイナミクスの変換可能なバイオマーカーを確立します。
- 前臨床的な有用性：化合物誘発性の細胞内小器官の再編成に関する早期に測定可能な指標を提供することで、リスク調整後の進展決定を支援します。
- メカニズム的な洞察：非球形構造に対する理論的な散乱モデルを必要とせず、オルガネラのサイズ、形状、および方向を反映する独自の形態計測パラメータを提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期の仮説検証からリード最適化に至るまで、細胞内ダイナミクスのラベルフリー評価を可能にすることで、創薬の連続的なプロセスに統合されます。ここでは、形態学的変化がパスウェイ調節や細胞の状態を示す機能的な指標として機能します。
- 探索生物学：アポトーシスや分化に関連する細胞小器官の配向変化を定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：再現性のある定量的出力（アスペクト比や配向マップなど）を提供し、集団間での化合物の効果の比較を可能にします。
- 解析：形態学的パラメータの統計分布を提供し、条件間の比較や細胞内組織化の有意な変化の特定を支援します。
- トランスレーショナルリサーチ：相関可能な光学信号および蛍光信号を通じて前臨床検証に結びつけ、細胞小器官のストレス応答におけるバイオマーカーの整合性を支援します。
- エンタープライズでの再利用：既存の顕微鏡で再利用可能なプラットフォーム機能として動作し、特殊な蛍光インフラへの依存を軽減します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：オルガネラのダイナミクスをラベルフリーで直接測定することにより、メカニズムの曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高める。
- 運用的価値：プラットフォームに依存しない実装と最小限のサンプル調製により、再現性と標準化を向上させる。
- 戦略的価値：機能的な結果に先立つ細胞内小器官の変化を早期に検出することを可能にし、後期の生物学的リスクを低減させることで、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：客観的かつ定量的な形態学的データを提供し、開発推進の判断に活用することで、リスク調整済みの優先順位付けを容易にする。
実施上の検討事項
- レーザー照射、DMDプログラミング、および最適な信号取得のためのケーラー調整を含む、光学系のセットアップ調整に関する専門知識が必要です。
- 空間光変調（例：DMD）が可能な装置と、フィルターベースの逐次的なイメージングのための同期画像取得システムに依存します。
- データの比較可能性を確保するため、画像取得プロトコル、露光時間、およびフィルターバンクのシーケンスについて、チーム間での標準化が必要です。
- モデルシステム間で適用する場合、細胞内小器官の屈折率や散乱特性に基づいて、照射強度およびフィルターパラメータの最適化が必要になる場合があります。
- 実用的な制限として、脱焦点光に対する感度や、長期的な生細胞イメージング中の安定した環境制御の必要性が挙げられます。
