二次元ガボールフィルタに基づく光散乱顕微鏡

このビデオでは、光散乱顕微鏡を使用して、アポトーシス中のミトコンドリアの断片化を定量化します。光学散乱顕微鏡法は通常、このプロトコルで蛍光を必要としませんが、蛍光画像は検証目的で取得されます。イメージングシステムのセットアップ後、細胞をMITトラッカーグリーンで標識し、ストースポリンで処理してアポトーシスを誘導します。

光学データを取得して、細胞小器官の向きの変化を2時間以内に検出します。ミトコンドリアの断片化の始まりは、細胞内粒子の配向度の低下を示す光散乱データを使用して測定できます。次に、光学散乱データをミトコンドリアを含む蛍光領域と相関させることにより、データを検証します。

こんにちは、ラトガース大学医用生体工学科の生物光学研究所のナダ・ブスターニです。私はバイオオプティクスラボのロブ・パック、そして同じくバイオラボのディーンです。今日は、蛍光色素に依存しない方法を使用して細胞内形態学的ダイナミクスを定量化する手順を紹介します。

私たちの研究室では、この技術を用いて、アポトーシスやプログラム細胞死時の細胞内構造のダイナミックな変化を研究しています。それでは始めましょう。この手順は、手袋をはめた手を70%エタノールで滅菌することから始めます。

次に、Miot Tracker Greenの調製した100ナノモルストック溶液を、ライトをオフにしてフードに温めたBAEC細胞培養培地に入れ、すべての表面を滅菌します。次に、フードの下のカバーガラスに細胞をメッキした6ウェル培養皿を置きます。バキュームラインに接続されたペーストピペットを使用します。

ウェルから細胞培地を取り出します。次に、すぐに2ミリリットルの標識培地を各ウェルに加えて、細胞を標識します。ミトコンドリア。組織の培養プレートを覆って、室内の直射日光にさらされないようにし、細胞をインキュベーターにすばやく戻します。

細胞がインキュベートしている間、摂氏37度で45分間インキュベートします。光学セットアップを準備し、最初に水銀アークclをオンにしますamp.次に、コンピューター顕微鏡カメラの電源を入れ、デジタルマイクロミラーデバイスまたは回転ディフューザーのDMDをレーザープラグします。

次に、顕微鏡の接眼レンズを覗いて、光学発射が位置合わせされているかどうかを確認します。視野はレーザー光で明るく照らされている必要があります。サンプルをロードするには、63 x オイル浸漬対物レンズを 1 〜 2 滴の液浸オイルに 1 〜 2 滴垂

次に、ステージ上にグラディと呼ばれる10マイクロメートル間隔の線のグリッドで構成されるスライドを取り付け、オイルが焦点を合わせるように対物レンズを持ち上げます。次に、コンデンサーフィールドの六角形のエッジに焦点を合わせます。中央のコーラー照明に揃うように停止します。

六角形のエッジは接眼レンズの中央にあり、鋭く焦点が合っている必要があります。次に、コンデンサーフィールドの停止位置ノブの中央、コンデンサーフィールドを使用して、視野上で停止します。IPラボを起動し、カメラを操作するための設定を入力します。

カメラがフレーム転送モードに設定されていることを確認します。acquire focus コマンドを実行して、ライブ プレビューを開始します。次に、インデックスのプレフィックスと、画像を保存するファイルの場所を設定します。

次に、RSイメージを開始します。クールスナップカメラを操作するための設定を指定します。クロッキング モードは normal に設定する必要があります。

DMDソフトウェアを起動します。暗視野の虹彩をスクリプトメニューに配置します。次に、[ロードしてリセット]をクリックします。

スクリプトを手動で実行するには、ビューポートの顕微鏡のオプティブバーをLSMに設定します。これにより、アライメントされた光学系のDMDを介して画像が送信されます。Cascade five 12カメラのCCDに暗視野画像を投影します。

暗視野画像は、IPラボのライブプレビューに表示されます。必要に応じて、ライブプレビューに画像の焦点を合わせます。画像内の信号が少なくとも 10, 000 カウントになるように、露出時間を十分に高く設定します。

次に、取得後に acquire single コマンドを使用して視野のスナップショットを撮ります。「インデックスとして保存」コマンドを使用して、イメージをディスクに保存します。GTIの画像は、視野のサイズを測定します。

次に、GTI サンプルを移動して、視野を越え、背景のみが表示されるようにします。少なくとも5, 000カウントを取得するのに十分な露光時間でフィールドの背景画像をキャプチャします。この画像は、フィルタリングされていない画像の背景の減算に役立ちます。

次に、背景のGaborフィルタリング画像を取得するには、GaborフィルターバンクスクリプトをDMD制御ソフトウェアにロードします。スクリプト全体を実行して、フィルターを DMD のオンボード メモリにバッファーします。スクリプト全体がバッファリングされると、これには数分かかる場合があります。

DMDソフトウェア内のスタートマーカーとストップマーカーを使用して、一度に1つのGabor Likeフィルターに対応するフィルターのセットが1つだけロードされるようにします。スクリプトを実行して、背景のフィルタリングされた画像を取得します。ライブ画像のプレビューが暗視野からフィルタリングされた画像に変わります。

そのフィルタについては、ディスクからIPラボで取得スクリプトを開きます。露出時間を調整して、少なくとも2000カウントが取得されるようにします。DMD スクリプトの実行中に、IP ラボでのライブ プレビューをキャンセルし、集録スクリプトを実行します。

これにより、フィルタリングされた画像が自動的にインデックスを取得し、ディスクに保存されます。最初の画像が取得されたら、DMD で実行されているスクリプトを停止します。使用したコマンドをスクリプトから削除します。

次に、次のフィルターセットの先頭と末尾の開始マーカーと停止マーカーを置き換えます。フィルターバンク全体を使用し、フィルタリングされたすべての画像を取得して保存するまで、IPラボで取得を繰り返します。ラボのベンチトップにはんだごてを差し込み、L 15培地を摂氏37度に加熱して、セルを播種する準備をします。

ペーパータオルとキムワイプを備えたワークステーションを作成して、こぼれた媒体を吸収し、領域を清潔に保ちます。キムワイプを引き裂いて回転させて、いくつかの芯を準備します。芯は、細胞プレートを通して液体を引き込むために使用されます。

次に、金属製のサンプルホルダーを使用してセルサンドイッチを作成します。シリンジを使用して、機械加工された金属板の穴の上部の周囲に真空グリースの薄いビーズを塗布し、両側の溝の端まで約半分伸びます。きれいなナンバーワンカバースリップをグリースにそっと渡します。

プレートを裏返し、穴の周りにグリースを塗ります。エタノール滅菌NI試験用手袋を着用して、部屋の照明を消してください。インキュベーターから細胞を取り出します。

実験に使用するカバースリップを6ウェルプレートから取り外します。カバースリップを丁寧に乾かします。次に、カバースリップセルを下にして、グリースを塗った金属プレートに押し込みます view穴の上の。

プレート内に細胞を挟みます。エアギャップが残っていないこと、およびグリースが水密シールを形成して媒体を装填できることを確認してください。次に、プレートを裏返して、一度に200マイクロリットルをピペッティングします。

プレウォームL15メディウムを、アッパーカバースリップと金属プレートの間の溝からサンドイッチに加え、液体が反対側の溝にほぼ到達するまで加えます。次に、反対側の溝に芯を保持し、さらに200マイクロリットルの培地をサンドイッチにピペッティングして細胞を洗浄します。芯が古い媒体を取り除くと、媒体は一方の側からもう一方の側に流れます。

このステップ中に液体内に気泡が形成されないように注意してください。すすぎのたびに新しい芯を使用して、このプロセスを2〜3回繰り返します。次に、プレートを端から支えてプレートをもう一度反転させ、セルリザーバーに液体を閉じ込めます。

はんだごてをビーカーに浸して、ビープの一部をすばやく溶かし、はんだごての先端にくっつきます。はんだごての先端を使用して、底カバースリップの端に脱皮ビープを慎重に塗布します。カバースリップの周囲を浸して塗布し続け、金属板に密封します。

これにより、優れたメカニカルシールが作成され、見ているときにカバースリップがプレートから外れることはありません。底から残留物を取り除きます。キムワイプを鳴らしてカバーを掃除して、滑り面を覆います。

1回のスライド動作で滑り込ませて、カバースリップが見える中央で最もきれいになるようにします。6つの壁のプレートをインキュベーターに戻します。めっきしたセルを光学ラボに持って行き、対物レンズに取り付けます。

前回と同様に、健康そうな細胞のフィールドを見つけ、視野の暗視野画像を取得します。次に、顕微鏡をDICに合わせ、露光時間が適切であることを確認します。カスケードカメラでDIC画像を取得します。

このセットアップでは、顕微鏡をDICに位置合わせしたまま、クールSNAPカメラを使用して蛍光画像を取得します。顕微鏡のVARを1 xに、ビューポートを100%双眼に設定し、画像を接眼レンズからカメラにそらします。コンデンサーの上に青色のLEDを配置して、フィールドを照らします。

次に、RSS画像で視野をプレビューし、ファインフォーカスを調整します。必要に応じて、DICイメージを取得し、ディスクに保存してください。視野がカスケード カメラから取得した視野とどのように異なるかに注意してください。

これらの画像は、実験の分析段階で登録する必要があります。次に、蛍光フィルターキューブを所定の位置に移動させ、顕微鏡シャッターを使用して蛍光励起を短時間オンにして蛍光画像を取得し、取得が完了したらすぐにオフにします。光退色を最小限に抑えるには、蛍光画像をディスクに保存します。

フィルタリングされた画像を取得するには、顕微鏡をフィールドにリセットし、LSMポートを介して光を送信します。前回と同様に、前と同じようにGaborフィルタバンクスクリプト全体を実行して、セルがまだステージ上にある間に、視野を乱すことなく、1つの時点のデータ取得を完了します。ウィッキング法を使用して、通常のL 15培地をSTSの1マイクロモル溶液を含むものと交換します。

実験の過程で、培地をステージから取り除いたり視野を乱したりすることなく、培地を細胞プレートの溝にピペッティングして乾燥を防ぐために、追加の培地を追加します。次に、実験が完了するまで、後続の時点に対してこれらの手順を繰り返します。収集されるデータには、細胞内構造データを抽出するために処理する必要がある多数のフィルタリングされた画像が含まれます。

ここでは、2 つの実験例を示します。この図は、海産珪藻藻類のサンプルの連続画像を示しています。指向性の特徴がはっきりと見えます。

暗視野イメージング。5が0度に等しいから5が160度に等しいとラベル付けされた光学的にフィルタリングされた画像は、サンプルのフィルタリングされていない画像と一緒に表示されます。比較のために、珪藻の9つのGaborフィルタリング画像のセットを、オブジェクトの向きについてピクセルごとに処理しました。

各ピクセルで、最大信号を平均信号で割って、フィルターの向きの関数としてアスペクト比の値を求めました。ここで、青色で示されるものに近いアスペクト比は、好ましい応答角度がない領域に存在します。赤で示される値が大きいほど、より高い優先角度応答が存在する領域を示します。

GABORフィルタの全応答の明るさとコードの重要性、フィルタの向き、各ピクセルで最大信号を与えることは、基礎となるオブジェクトの向きに垂直な方向に対応します。サブストラクチャーの粒子配向は、各線がフィルタリングされていない暗視野で見える基礎となる局所的な物体の向きと密接に一致する矢筒プロットにエンコードされます。quiverプロットは、応答強度が最大値の10%を超えるオブジェクトの向きを示しています。

これらの暗視野および光学的にフィルタリングされた視野の画像は、生きたウシ内皮細胞を含んでおり、続いて、アポトーシス誘導剤stor sporinによる処理後3時間にわたって20分ごとにフィルタリングされた画像が取得された。ここでは、上段のアスペクト比マップと下段のミトコンドリアの蛍光イメージングを時間の関数として示しています。これらの時間プロットが、sトロスポリンで処理された内皮細胞における粒子のアスペクト比の配向度の減少を比較する前に、個々のトレースが単一細胞内の時間プロットを表す前に、色相は配向の程度を表す。

ドロップイン指向性は、蛍光領域に登録される細胞の領域に限定されます。今回、蛍光に対する検証が達成されました。アーカイブになります。

したがって、次の実験では、蛍光イメージングステップを省略し、光散乱法を直接使用することで、ミトコンドリアの測定を行うことができます。アポトーシス中のミトコンドリアの断片化を、Gaborフィルターに基づく光散乱シグネチャーを使用してモニタリングする方法を紹介しました。この手順を行うときは、ライフスタイルの準備をしっかりと行い、光学セットアップが適切に調整され、校正されていることを確認することが重要です。

それでは、CoLabのUI実験