Name: キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュのGFP発現割球移植法による網膜と脳の発生過程のライブイメージング。この手法は遺伝的背景を変えた細胞の運命を正常胚内で追跡し、発生生物学の理解を深める。

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NIHグラントR01EY016099と盲目のキャリア開発賞を防止する研究：この研究は国立衛生研究所（NIH）コアグラント（5P30EY008098）と、以下の資金XWのによってサポートされていました。我々は、共焦点イメージングにおける援助のためにキラのラスロップに感謝。

1日目。準備 1。魚の交配を設定する夕方にはゼブラフィッシュのペア十字架を設定します。希望の時間の前にランダムな交配を防ぐために、交配のカセットで、女性と男性の魚を分離する仕切りを使用してください。 GFP -発現するトランスジェニックフィッシュとドナー割球のソースとして使用されます。 pt104トランスジェニックライン（ゾウら 、2008）、ここで使用される、EF1プロモーターの制御下で普遍的にGFPを発現する。 GFPの発現は、ライブイメージングによるドナー細胞の可視化を可能にする。適切な蛍光タンパク質を発現させる他のトランスジェニック魚の行は、特定のニーズに合わせて使用​​することができます。 2。保持する胚のためのくさび形のアガロースの井戸を準備シャーレにE3卵水（ウェ、2007）で調製した溶融1％アガロースを、、注ぐ。アガロース溶液にくさび状突起を持ち、アガロース溶液が完全に固化させプラスチック金型をフロートさせます。慎重に金型を取り外し、E3水でアガロースのベッドを浸す。 3。移植針を準備ガラスキャピラリーピペット（世界の精密機器を）引いて針を作るために11.5電力設定で垂直ニードルプラー（デビッドKopfは楽器を）使用してください。良い針先は長いシャフトでテーパーすべき。内径40 -45μmの傾斜開口部が得られるまでマイクログラインダー（Marishige）と45度の角度で針先を挽く（図1A）。針先をクリーンアップするには、吸うと表示されているすべての残骸が削除されるまで10％フッ化水素酸溶液を解放して注射器にホースを接続し、針の平滑末端にホースを取り付け、と。次に、100％エタノール、続いて蒸留水でのヒントを洗う。すべてのエタノールが蒸発するまで針を空気乾燥させる。残留エタノールは、高温の研磨工程の間に針を台無しにする：ヒントが完全に乾いていることを確認することが重要です。針の先端のギザギザを柔らかくし、研磨する、マイクロ捏造（Marishige）のフィラメントによって発生する熱と針の先端を焼く。針の先端が研磨中にフィラメントを接触させてはいけません。フィラメントと針の先端との間のフィラメントとの距離も通過する電気の量は、所望の加熱条件を達成するために調整することができます。温度が高すぎるすべきではない：これは、針の先端を溶融して変形します。粗いエッジが平滑化された後、慎重に針の先端に加熱されたフィラメントに触れ、その後穏やかに先端（図1B）を生成するために針から離れてフィラメントを引き出します。 、シャープな滑らかな、そしてきれいな針はそのままドナー割球を得るためと宿主胚を損傷しないために重要です。 4。胚位置決めプローブを準備滑らかに端を細いガラスプローブを得るためにガスの炎を介してガラスピペットを引き出します。このプローブは、移植に先立って適切な向きに胚を配置するために使用されます。 2日目。割球移植 1。収集とdechorionate胚翌日、チームメイトに魚を可能にするクロスカセットに仕切りを削除する。 E3水を満たしたシャーレに胚を置きます。その後、手動で微ピンセットで胚からchorionsを離れて引き裂くことによりdechorionate胚。慎重にアガロースウェルにdechorionated胚を転送するために曲がったシャフトをガラスピペットを使用してください。バーストに胚を引き起こす空気と胚、任意の接触を避ける。胚は28.5で開発℃で3時間後に受精、またはHPFになるまでアガロース井戸でCをしましょう​​。 2。移植装置を設定する胚が発達しながら、鉱物油で満たされたマイクロポンプシステムへの移植の針を接続することにより、移植装置を設定します。システムがリークされず、空気の泡がシステムの中に閉じ込めされていないことを確認します。先端開口部のスペースを1μl - バック0.5を除いて、ミネラルオイルを全体移植針を埋める。 3。割球の移植割球を移植する、上方3 - 4 - HPFの胚の割球側をオリエンテーションするガラスの位置決めプローブを使用してください。その後、そっとドナー胚に移植針を挿入し、ゆっくりと針に5〜20割球を吸い上げる。宿主胚に割球を充填した針を挿入し、徐々に割球を離します。彼らの子孫が後の発達段階でローカライズどこ割球がリリースされるサイトが影響します。網膜と脳の発達、動物極でのリリースの細胞を分析する。移植時に、針の先端が空気に接触しないことを確認してください。機械的損傷を最小限に抑えるために、宿主胚は、次の日まで、28.5 ° Cでアガロースのウェルに残されるものとする。次に、t各ウェル内の1つの胚を、1％アガロース、0.5 mlのプレコートした24ウェルプレートにモザイク胚のケース温度。 E3卵の水1 mlを各ウェルに追加されます。細菌感染を防ぐために、E3卵の水に100倍のペニシリンとストレプトマイシンの10μlを加える。 3日目。埋め込みとモザイク胚のライブイメージング 1。埋め込み胚 E3卵の水に1.5％低融点アガロース（LMP）を準備し、30℃の水浴でソリューションを維持。厚さ0.17ミリメートル（世界の精密機器）のグラスの底部とFluoroDish組織培養皿にモザイク胚を移す。ちょうどE3の最小限の量でカバー胚を残すために余分なE3の水分を取り除く。胚30〜50μlを溶かした1.5​​％LMPを追加。アガロース溶液が固化する前に、可能な限り迅速にガラスの底の近くに眼や脳を配置します。解決策が冷却した後、さらに場所の胚を確保するために追加のアガロース溶液を加える。その後、2〜3ミリリットルE3の卵の水で固化したアガロースブ​​ロックを浸す。 2。共焦点像共焦点顕微鏡の場合は、大規模な焦点深度の水浸反転目標（オリンパス、PlanApo、40 X/0.90 WLSM、日本）が使用されます。水の滴は、客観的に追加して、客観的にFluoroDish組織培養皿を置いています。画像の開発に、胚の写真を撮り、5分ごとにタイムラプスイメージングを行う。実験の性質に応じて、ショットの間の時間間隔を調整する必要があります。 代表的な結果図2は、代表的な24 - HPFモザイクのゼブラフィッシュを示しています。 GFPの発現は、緑のドナー細胞を強調。網膜神経上皮細胞は網膜の壁の厚さ全体に及ぶ。 映画は24 HPFでのホストの脳におけるドナー細胞の動きを示しています。時間をかけて細胞の形態変化に注目してください。 <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。移植の針先の形状。 A.は、針の先端の斜めの開口部は、フッ酸洗浄後の残骸の自由だ。 B.先端が針の先端に生成されました。 <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。24 HPFにおけるキメラゼブラフィッシュの胚におけるGFP発現ドナー細胞の可視化。左側のパネルには、脳と網膜におけるGFPのシグナルを示しています。中央のパネルには胚の明視野像である。右側のパネルには、マージされた画像を示しています。 映画は1。GFP陽性ドナー細胞のイメージングが開発中の脳の神経上皮細胞の形態には大きな変更を示したライブ。映画の個々のフレームは、24及び25 HPFの間に5 ​​分ごとに収集された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">映画を見るにはここをクリック</a> 。

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

このビデオでは、我々はゼブラフィッシュの網膜や脳の発達を分析する割球移植する方法を示しています。このプロトコルはまた、単に、ホスト胚の対応する場所にドナー割球を放出することによって、他の組織や器官の発達を分析するために使用することができます。 GFP分子による標識は、蛍光色素標識デキストラン（ホーとケイン1990）で標識よりクリーンなバックグラウンドをもたらします。死ドナー細胞からデキストランの色素の破片は、このようにイメージング（カタラーノら 、2007）と推測する、GFPよりもはるかに長く続くためです。さらに、GFP陽性ドナー細胞は、デキストランの染料を含有するものよりも健康です。

E3の卵の水： <ul><li> 5mMのNaClを</li><li> 0.17 mMのKClを</li><li> 0.33 mMのCaCl 2を </li><li> 0.33 mMのMgSO 4を </li><li> 0.1％メチレンブルー</li></ul>

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのgfp発現割球の移植

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

細胞は、胚形成の間にその場所とプロパティで広く変わる。これらの変化は、細胞とその環境との相互作用によって調節される。異なる遺伝的背景のセルで構成されているキメラ胚は、、、目的の遺伝子により媒介される細胞間相互作用を研究するための優れたツールです。初期の発達段階におけるゼブラフィッシュの胚の透明性は、細胞レベルでの組織や臓器の形態形成の直接可視化を可能にします。ここで、我々は、ゼブラフィッシュ胚におけるキメラ網膜と脳を生成するために、ドナー細胞のライブイメージングを実行するプロトコルを示しています。プロトコルは、移植針、GFP陰性のホストへのGFP発現ドナー割球の移植、およびライブ共焦点顕微鏡下でドナー細胞の挙動の試験の準備をカバーしています。若干の修正で、このプロトコルはまた、ゼブラフィッシュの他の組織や臓器の胚発生を研究するために使用することができます。ラベルのドナー細胞にGFPを使用する利点についても説明します。

我々は、胚発生時のライブイメージング細胞挙動のためのキメラゼブラフィッシュの胚を生成するプロトコルを示しています。

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

胚発生の間、細胞はその位置と特性を大きく変化させます。これらの変化は、細胞とそれらの……との間の相互作用によって制御されています。

ブラストメア（割球）は、発生の卵割期に形成される胚細胞です。ここでは、移植用針を用いて、GFPで標識したブラストメアをあるゼブラフィッシュ胚から別の胚へと移植します。この手法により、遺伝的背景を改変したブラストメアの挙動や運命を、それ以外の部分は正常な胚の中で、あるいはその逆の条件下で、生体顕微鏡イメージングによって追跡することが可能になります。こんにちは、ピッツバーグ大学眼科Department of OphthalmologyのDr.Shaweの研究室に所属するDr.Zoranです。本日は、ゼブラフィッシュ胚における脳脊髄液の輸送手順についてご紹介します。当研究室では、この手順を用いて網膜および脳の発達について研究しています。それでは、始めていきましょう。ランダムな交配を防ぐため、夕方にゼブラフィッシュのペア交配の準備を行います。希望の時間になる前に、ディバイダーを使用して雌魚と雄魚を分離させます。こちらです。GFP発現トランスジェニック魚をドナー胚盤胞の供給源として使用します。PT 1 0 4トランスジェニック系統は、EF oneプロモーターの制御下でGFPを普遍的に発現します。胚を保持するためのアグロスウェルを準備するため、E three egg waterで調製した1%アグロス溶解液をシャーレに注ぎます。くさび状の突起を持つプラスチック製モールドを、アグロス溶液の上に浮かべます。その後、冷却させます。慎重に凝固させるため、型を取り出し、アガロースベッドを三等分水（E three water）に浸します。次に、移植用針を準備します。垂直型ニードルプラーをパワー設定11.5で使用して、ガラスキャピラリーピペットをプルします。良好なニードルチップは、長いシャフトを持ち、先が細くなっている必要があります。マイクログラインダーを用いて、内径30から40 µmの面取りされた開口部が得られるまで、ニードルチップを45度の角度で研磨します。ニードルチップを洗浄するため、鈍端にホースを取り付け、そのホースをシリンジに接続します。次に、10%フッ化水素酸溶液を吸引および放出することを、目に見えるゴミがすべて除去されるまで繰り返します。最後に、チップを蒸留水で洗浄します。次に100% ethanolを用いて、ethanolがすべて蒸発するまで針を風乾させます。先端が完全に乾燥していることを確認することが重要です。ethanolが残っていると、高温研磨中に針が損傷します。ステップ2では、ニードル先端の粗いエッジを滑らかにし、研磨するために、マイクロフォージャーのフィラメントから発生する熱で焼成します。研磨中は、ニードル先端がフィラメントに触れないようにしてください。フィラメントを流れる電流の値と、フィラメントとニードルの間の距離を調整することで、希望する加熱条件を得ることができます。温度が高すぎないように注意してください。温度が高すぎると、粗いエッジを滑らかにした後にニードルチップが溶けて変形してしまいます。加熱したフィラメントにニードルチップを慎重に接触させ、その後、フィラメントをゆっくりと引き離して尖った先端を作成します。ホスト胚を損傷することなく、無傷のドナー芽細胞（ブラスター）を回収するためには、鋭利で滑らかかつ清潔な針が不可欠です。ガス火でガラスピペットを加熱しながら引き伸ばし、先端を滑らかに整えた微細なガラスプローブを作成します。このプローブを用いて、移植前に胚を適切な向きに配置します。実験当日、魚が交配できるようにクロスカセットの仕切りを取り除きます。8. 30分後、胚をネットに注ぎ込み、100から200個の胚を回収します。回収した胚をE3溶液を満たしたペトリ皿に入れます。次に、精密ピンセットを用いて、CORを物理的に剥がし、胚のコートを除去します。その後、先端が曲がったガラスピペットを使用して、コートされた胚を慎重にアロスウェルに転移させます。胚が空気に触れると破裂の原因となるため、注意してください。受精後3時間（HPF）になるまで、胚をアロスウェル内で28.5 °Cで発生させます。移植用ニードルをミネラルオイルを満たしたマイクロポンプシステムに接続し、移植装置を準備します。システムに漏れがなく、気泡が混入していないことを確認してください。移植用針の先端開口部から0.5〜1 µLの空間を除き、針全体にミネラルオイルを満たします。インキュベーターから胚を取り出し、顕微鏡のステージ上に載せてblasphemeの移植を行います。ガラス製のポジショニングプローブを使用して、3〜4 HPFの胚のblaspheme側を上向きに調整します。次に、移植用の針をドナー胚にゆっくりと刺入し、5〜20個の芽細胞を針の中にゆっくりと吸い上げます。このとき、移植中に針先が空気に触れないように注意してください。芽細胞が入った針をホスト胚に刺入し、芽細胞をゆっくりと放出します。芽細胞の放出部位によって、後の発生段階でその子孫細胞が局在する場所が変わるため、網膜および脳の発達を解析する場合は、動物極に細胞を放出してください。他の組織や器官の発達を解析する場合は、適宜、異なる放出部位を検討してください。移植時の機械的損傷を最小限に抑えるため、ホスト胚を翌日まで28.5 °Cのアグロスウェル内に保持します。その後、モザイク胚を、0.5 mLの1%アグロスでプレコートし、1 mLのE3卵水を満たした24ウェルプレートに移植します。細菌感染を防ぐため、各ウェルに 10 µL の 100 x ペニシリン・ストレプトマイシンを添加し、胚を 1 個ずつ加えてください。各ウェルに低融点アガロース（LMPアガロース）を計量して調製し、溶液を 30 °C の恒温槽で保持します。モザイク胚を、厚さ 0.17 mm のガラス底フローラディッシュに転移させます。胚がちょうど浸る程度に、余分なE3溶液を取り除きます。次に、1.5% LMP溶液が凝固する前に、溶融した1.5% LMPを30～50 µL、胚に素早く加えます。眼または脳を、ガラス底にできるだけ近づけて配置してください。溶液が冷却した後、さらにアグロス溶液を加え、胚をしっかりと固定します。凝固したアグロスブロックを2〜3 mLのE3卵水に浸し、共焦点顕微鏡で観察します。焦点深度の深い40倍の水浸倒立対物レンズを使用します。対物レンズに水を1滴滴下し、ステージ上にフローラディッシュ組織培養皿を配置して、画像形成のためにピントを合わせます。5分おきに胚の写真を撮影し、タイムラプスイメージングを行います。実験の性質に応じて、撮影の間隔は調整可能です。ここでは、受精後24時間（24 HPF）のゼブラフィッシュの代表的な画像を示します。GFPの発現により、ドナー細胞が緑色に強調されています。網膜神経上皮細胞は、網膜壁の全層にわたって分布しています。この動画では、移植後24時間（24 HPF）におけるホスト脳内のドナー細胞の挙動を示しています。時間の経過とともに細胞形態が変化することに注目してください。ゼブラフィッシュにおける乳腺ミラー輸送の実施方法を解説します。この手順を行う際は、移植乳腺領域に慎重に適切な針を準備することが重要です。以上で完了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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