でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル
May 16th, 2010
アニマルキャップを過剰発現する遺伝子産物（s）を開発の側面に移植されていますアフリカツメガエル胚組織が決定されているかどうかを確立するため。
A CTアッセイの全体的な目標は、目的の遺伝子が特定の細胞運命に対して原始的な皮膚を特定できるかどうかをテストすることです。この手順は、まず、蛍光レポーター遺伝子とXUS lavis胚の発生に関心のある遺伝子のコードでRNAを過剰発現することから始まります。次のステップは、過剰発現したRNAを発現するアニマルキャップまたは原始的な臭気を解剖し、それらをステージ15まで成長させることです。
手順の3番目のステップは、ステージ15の宿主胚の側面にある組織を切除することです。最後のステップは、ドナーの動物キャップ組織の半分を宿主胚の側面に移植し、宿主をステージ42から43まで成長させることです。その結果、組織特異的マーカーの切片化と免疫染色による眼様構造などの異所性組織形成が示されました。
こんにちは、私はアップステート医科大学の眼科にいます。今日は、私がMike Suberと共同で開発したアニマルキャップ移植アッセイと呼ばれる手順をお見せします。私たちは、このアッセイを両方の研究室で使用して、眼の形成に十分な遺伝子を研究しています。
それでは始めましょう。この手順を開始するには、ノギンまたは別の目的の遺伝子を注射転写するためのキャップRNAと、トレーサーとして使用するYFPを準備します。また、MMRベースの溶液、8 x産卵液のストック、および胚を注入するための針を準備します。
カスタムメイドのエラストマー型を使用して、胚を保持する皿を作ります。1%AROSを0.4 XMMRで溶かし、1つの実験条件につき1枚のインジェクションプレートを作製します。約6ミリリットルの溶液を60ミリメートルプレートに移します。
泡を防ぐために溶液の上にエラストマー型をそっと置き、約20分間冷まします。室温で、射出プレートについて示したように、1%AGROSと0.7 XMMRをモールドと共に使用して、実験条件ごとに1つのキャップアイソレーションプレートを生成します。各時点ごとに追加のプレートを準備します。
タイムポイントの計算の詳細については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。次に分離します。オスのカエルからこれらをテストし、組織を摂氏4度で、1ミリリットルあたり50マイクログラムのゲンタマイシンを補充した1つのXMMRの滅菌溶液に保存します。.
これは実験開始の1週間前まで行うことができますが、精子は時間の経過とともに、マイクロインジェクションの前日の遅い時間に効果を失うことに注意してください。女性に500単位のヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射します。.女性を摂氏16〜18度に一晩置きます。
これで、翌日のマイクロインジェクションの準備が整いました。まず、ホルモン誘発された雌を取り出し、1つのXELSが入った個々のタンクに入れます。先端を切り取ってマイクロインジェクション用の針を準備します。
直径25〜35マイクロメートルを得るには、PLI 100ピコインジェクターに針を置き、注射ごとに10ナノリットルを分注するようにキャリブレーションします。インキュベーターを摂氏14度に設定して、出口をこの低い温度に配置し、RNAを注入した後、胚の発達が遅くなり、受精の約1時間前に1回の実験でさらに多くの移植を行うことができます。メスがさらに1時間産卵したら、トランスファーピペットを使用して、新しく産まれた卵をタンクから取り出します。
ELS溶液に2時間以上浸かっている卵は使用しないでください。卵の品質が低下したら、卵を60ミリメートルのペトロ皿に入れます。この料理は、卵の単層で約80%が満たされています。
卵からできるだけ多くのELSを取り除き、1つのXMMRと交換します。卵は1つのXMMRに最大1時間留まることができます。次に、均質化された精巣で卵子を体外受精させます。
胚が希望のステージに成長できるように、正午の午前11:00と午後1:00頃に3つの別々のバッチで受精するのが最善です。卵子を受精させてから1時間後、0.1XMMRをたっぷりと含ませたDゼリー溶液洗浄で卵子のゼリーコートを取り除き、受精卵が2細胞期に達するまで待ちます。
並べ替えを開始します。0.4 XMMRと6%F ccalを充填した注射皿を準備します。胚が2細胞段階に達したら、トランスファーピペットを使用して、均一に色素沈着し、均等に分割された胚を注入皿のウェルに選別します。
60ミリメートルのペトロ皿の蓋の上にマイクロインジェクションの最初のストレッチパーフィルに進みます。2マイクロリットルのRNAサンプルをバイオフィルムにピペットで移し、吸引します。ピコインジェクターを使用して注射針を充填します。
注射を開始する前に、針がまだ10リットルのサンプルを分注していることを必ず確認してください。RNAは、2つの細胞期の胚を介して両方のブラスターに注入されます。20〜30個の胚にそれぞれ500ピコグラムのY-F-P-R-N-Aを注入し、1つの皿に入れます。
さらに20〜30個の胚に、それぞれ20ピコグラムのNain(Y-F-P-R-N-Aと予め混合したRNA)を注入し、皿に入れます。さらに、注入した胚を任意の時点あたり100〜200個のuninを、FICO溶液を含む別の注入皿に入れる。これらの胚は、注入された胚と同時にインキュベーターに出し入れします。
これらは、注入後にキャップを移植するために使用されるホストです。すべての胚を摂氏14度で一晩インキュベートします。計画されたすべての時点について繰り返します。
一晩の孵化後、動物のキャップを分離することができます。早朝に到着して胚をステージングします。また、インキュベーターからunin注入された宿主胚も取り出すことを忘れないでください。
最も早い時点はステージ 9 である必要があります。まず、生き残らなかった胚を取り出します。生存可能な胚から動物用キャップを分離し、各時点をバッチでキャップ分離皿に取り込む
。0.7 XMMRとゲンタマイシン溶液をたっぷりと加えます。次に、注入した胚を含む各プレートからfol溶液を注ぎ出し、0.7 XMMRとゲンタマイシン溶液を再び加えます。トランスファーピペットを使用して胚を注入皿ウェルから取り出し、新たに調製したキャップ分離皿に入れる。
400マイクロメートルに曲がった黄色の先端が取り付けられた胃マスター、または鋭利な5番の鉗子のペアを使用して、0.7 XMMRとゲンタマイシン溶液で動物用キャップを分離します。ステージングのために2つまたは3つの無傷の胚を保持します。動物のキャップを分離した後、キャップが宿主胚の側面に移植される翌日まで、宿主胚と一緒に摂氏14度のインキュベーターに戻します。
14°Cインキュベーターから最初の時点からキャップとホスト胚を取り外し、均一な蛍光陽性キャップのために胚の種類をステージングします。キャップの数を数えて取り外します。0.7 XMMRとシャープな5本の鉗子を持つゲンタマイシン溶液を添加した、作りたての注入皿に宿主胚の数を2倍に増やします。
各宿主胚からLene膜を切除します。キャップ付きのプレートに移しますが、レンメンブレンがないときは注意してください。胚は、最高設定で200〜250マイクロメートルの曲がったワイヤーを備えた黄色の先端が取り付けられた胃マスターを使用するか、5番の鉗子を使用して、水面ですばやく解離できます。
ステージ14〜15で胚の側面にある200マイクロメートル四方を取り除きます。その後、再び胃マスターまたはナンバーファイブの鉗子を使用します。キャップを半分に切り、宿主胚に開けた穴に組織を入れます。
胚を井戸に対して回転させて治癒させます。ステージ15にある胚の数をできるだけ多く胚に対して行います。すべての時点について繰り返します。
胚は通常30分以内に治癒します。そして、5番の鉗子で、白く見える死んだ細胞を穏やかなブラッシング動作で取り除きます。移植した胚を摂氏18度で一晩成長させます。
一晩のインキュベーション後、解剖蛍光顕微鏡下で作業し、蛍光標識された移植組織を含む胚を選別します。選択した胚を摂氏18度に戻し、ステージ42から43まで成長させます。動物が目的の段階に達したら、トリカで麻酔をかけ、蛍光解剖顕微鏡で調べて写真を撮ります。
移植された胚は、その後、固定、切片化、免疫染色を行うことができ、または目的の組織のマーカーを使用してin situハイブリダイゼーションを行うことができます。これは、移植の1日後に蛍光トレーサーとノギンを発現するドナー組織を持つ宿主オタマジャクシの代表的な結果です。ティッシュがオタマジャクシの側面でどのようにボール状になっているかに注目してください。
蛍光トレーサーのみを発現する制御されたドナー組織を受け取った宿主胚は、すでに動物キャップ細胞をその側面に取り込み始めています。数日後、ナインを発現するドナー細胞を受け取ったオタマジャクシは、側面に眼のような構造を形成し、対照ドナー組織を受け取ったオタマジャクシは、皮膚の表面に蛍光細胞を持っています。Zaps Lavisで動物キャップ移植アッセイを行う方法を紹介しました。
このアッセイを行うとき。その日の処置の前に、胚があなたがそれらに到達するよりも早く成長しないように、すべての準備ができていることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この研究は、発育中のウーパールーパーの胚における組織の運命を決定する遺伝子産物の能力を調査します。特定のRNAを過剰発現させることで、研究者は原始真皮の異なる細胞タイプへの特異化を理解することを目指しています。
主要な研究要素
科学分野
- 発生生物学
- 遺伝学
- 胚発生学
背景
- 動物冠は組織決定を研究するためのモデルとして使用されています。
- ウーパールーパーは発生研究の重要な生物です。
- 遺伝子機能の理解は発生プロセスへの洞察に不可欠です。
- 以前の研究では、遺伝子発現が細胞の運命に影響を与えることが示されています。
研究の目的
- 特定の遺伝子産物が原始真皮の運命を決定できるかどうかを判断すること。
- ホスト胚における異所性組織形成の可能性を評価すること。
- 遺伝子発現を追跡するための蛍光報告遺伝子を利用すること。
使用された方法
- 発育中のウーパールーパー胚におけるRNAの過剰発現。
- 過剰発現組織を分離するための動物冠の解剖。
- ドナー組織をホスト胚に移植すること。
- 組織特異的マーカーの免疫染色による結果の分析。
主要な結果
- 眼のような構造を含む異所性組織形成が観察されました。
- ドナー組織のホスト胚への成功した統合。
- 蛍光マーカーにより過剰発現遺伝子の発現が確認されました。
- 結果は遺伝子産物が組織の運命に影響を与えることを示しています。
結論
- 遺伝子過剰発現は組織特異化を効果的に決定できます。
- 移植技術は発生生物学への洞察を明らかにします。
- 将来の研究では、追加の遺伝子相互作用と経路を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The Animal Cap Transplant (ACT) assay enables functional validation of gene products in tissue fate determination, addressing a key challenge in target de-risking where pleiotropic effects obscure tissue-specific roles. By isolating pluripotent animal caps and assessing ectopic tissue formation in a host embryo, the assay provides a quantitative readout for gene sufficiency in specifying cell lineages. This supports early discovery workflows by improving target confidence and reducing false positives in phenotypic screening cascades.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a gene of interest is sufficient to drive a specific tissue fate, such as retinal cell specification.
- Operational Value: Uses fluorescent tracer co-expression to enable rapid sorting and quantification of successfully transplanted donor tissue.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing direct tissue-determining activity from indirect effects via tissue expansion.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, transplantable animal caps expressing genes of interest for consistent ectopic tissue assessment.
- Quantitative Output: Enables scoring of ectopic structure formation (e.g., eye-like tissues) via immunostaining for lineage-specific markers.
- Scalability: Supports batch processing of embryos and time-point staging for medium-throughput target evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests gene sufficiency in forming structured tissues like the eye, aligning with developmental disorder models.
- Translational Continuity: Bridges gene discovery to tissue-level phenotypes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct transcriptional regulation or secondary developmental effects.
Pipeline & Workflow Integration
The ACT assay fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing functional evidence for gene roles in tissue specification, informing lead identification and pathway prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining if a gene product can autonomously specify a cell fate in a naïve pluripotent context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative ectopic tissue readouts that enable comparison across genetic conditions.
- Analytics: Generates imaging- and marker-based readouts that support statistical comparison of tissue formation frequency and penetrance.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to structured tissue outcomes, relevant for modeling congenital defects or regenerative targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse gene sets (e.g., transcription factors, signaling molecules) across multiple tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by isolating tissue-specific gene functions from pleiotropic embryonic phenotypes.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation, transplantation, and host staging to improve inter-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by reducing investment in targets with indirect or non-specific effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on direct tissue-specifying activity rather than correlative expression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Xenopus embryo handling, microinjection, and tissue dissection.
- Dependent on microinjection instrumentation (e.g., picoinjector) and fluorescence-capable dissection microscopes.
- Necessitates standardized staging protocols and temperature-controlled incubation for consistent developmental timing.
- Requires validation of ectopic tissue formation using tissue-specific antibodies or in situ hybridization.
- Limited to tissues that can form detectable structures in ectopic locations; may not suit diffuse or early transient cell types.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:24
Setting Up for the ACT Assay
3:07
Preparing for Microinjection
6:30
Isolating Animal Caps from Injected Embryos
5:18
Microinjection
9:53
Animal Cap Transplant Assay Representative Results
10:34
Conclusion
7:49
Transplantation of Caps onto Flank
