ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

このプロトコルは、ビデオイメージング用のカメラを備えたicon bio station CTインキュベーターで収集されたタイムラプスビデオを分析することにより、ヒト胚性幹細胞コロニーの成長を測定するためのビデオバイオインフォマティクス法を示しています。ヒト胚性幹細胞またはHESCコロニーを70%coの流暢さまで培養し、再播種して48時間インキュベートした後、HESCコロニーをBiot CTでさらに48時間撮影します。成長率は、CL 定量ソフトウェアで開発されたセグメンテーション強化および測定レシピを使用して決定されます。

レシピは、各コロニーに正確に手動でマスクを合わせることができる画像解析ツールであるAdobe Photoshopと比較することで検証されます。ビデオバイオインフォマティクスという新しい分野は、顕微鏡ビデオからの生物学的データの処理、分析、マイニングを自動化するために使用できます。こんにちは、私はここカリフォルニア大学リバーサイド校の細胞生物学および神経科学部のDr.Prou Talbotの研究室のSerena Linです。

こんにちは、私は同じくタルボット研究所のショーン・フィノです。本日は、ビデオバイオインフォマティクスツールを使用してヒト胚性幹細胞コロニーの成長を測定する方法をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、環境毒物がヒト胚性幹細胞の挙動に及ぼす影響を測定しています。この手順は、新しい幹細胞コア施設でデモンストレーションを行います。それでは始めましょう。

ビデオ分析用のHESCを調製するには、HESCを含む1つのウェルから70%コンフルエント吸引培地になるまで、マトリゲルコーティングされた6つのウェルプレートでHESCを成長させ、1ミリリットルのPBSで2回すすぎます。1ミリリットルのアキュテインを加え、5%二酸化炭素中で摂氏37度で1分間インキュベートします。次に、ウェルに10〜12個のガラスビーズを加え、コロニーが完全に剥がれるまでプレートを静かに振ってください。

1ミリリットルのヒト胚性幹細胞メンテナンス、培地またはマウス胚性線維芽細胞馴化培地を使用してアキュテインを中和します。ビーズを含まない分離した細胞を15ミリリットルの円錐管に集め、200Gで3分間遠心分離します。SUPのnatantをデカントし、12ウェルのmatrigelによって塗られる版の複数の井戸に500マイクロリットルの新鮮な人間の胚の幹細胞の維持媒体またはMTESRのプレートのMTESRのプレートの100のマイクロリットルのHESCの中断液のペレットを落として分けます。

プレートを前後に静かに揺らし、光学顕微鏡で培養を観察して、細胞の塊がウェル全体に均一に分布するようにします。プレートを37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに48時間置き、細胞が平らに付着し、簡単に視覚化できる大きさであることを確認します。48時間後、培地を吸引し、ウェルを500マイクロリットルのPBSで洗浄して付着していない細胞を除去し、次にそれぞれに500マイクロリットルのM-T-E-S-R培地を追加します。

すぐにプレートをBiot CTにセットし、タイムラプス画像の収集を開始します。目立たない単一のコロニーが他のコロニーに成長する可能性が低いフィールドを選択するようにしてください。このプロトコルでは、細胞は、7分間隔でフレームを使用してさらに48時間ビデオ記録されます。

セグメンテーションレシピを最初に作成するには、ビデオ全体を手動でスキャンして、録画期間中ずっと焦点が合ったままの単一のコロニーが含まれていることを確認します。この後、CL quants ソフトウェアでセグメンテーションウィザードを開き、「次へ」ボタンをクリックします。正しい画像チャンネルを選択し、[次へ]ボタンをクリックします。

[ソフトマッチング] を選択し、[次へ] をクリックします。コロニーの中央領域に対して外縁を円を描くことにより、1つまたは2つの必要な領域を選択します。このエリアはできるだけ小さくする必要がありますが、コロニー全体を代表するものでなければなりません。

あまり多くの領域を選択しすぎると、マスクの適用が不正確になる可能性があるため、選択しないでください。[次へ]ボタンをクリックします。「Don't want regions by circling regions that not part of the colony and not part of the background」を選択します。

これらの領域には、破片や死んだ細胞など、抑制する必要があるパターンがあります。「次へ」をクリックします。コロニー、破片、または死細胞ではない領域を一周して背景を選択します。

背景は均一で、すべてのフレームに表示される可能性が高い必要があります。通常、コロニーの周りの灰色の背景を選択します。[次へ]ボタンをクリックします。

マスクが関心領域を正確にカバーしていない場合は、色付きのマスクを関心領域の上に表示する必要があります。画面の右下隅にあるセグメンテーションしきい値の範囲は、マスクの変更が必要な場合に増減できます。ソフトマッチング地域を更新します。

これにより、不要な領域や背景の領域を変更できます。マスクに問題がなければ、「しきい値を適用」を選択し、マスクを保存します。次に、[次へ]ボタンをクリックします。

その後、マスクは別の色で表示されます。[完了] を選択します。レシピは、セグメンテーションレシピとしてソフトウェアの右上隅に表示する必要があります。

必要に応じて、右クリックして新しい名前を入力して、レシピの名前を変更します。レシピを適用します。右クリックしてマウスを置きます。

レシピを適用します。使用するフレーム数を選択できるメニューが表示されます。フレーム間隔を 20 フレームごとに設定して、マスクの忠実度を確保します。

マスクが適用されたフレームの10%をランダムに手動でスポットチェックし、破片の不要な領域を排除する強化レシピを作成します。拡張レシピフォルダを右クリックし、[新規]をクリックします。新しい拡張レシピは、元の視野から表示する必要があります。

ツールバーのアイコンの上にマウスを移動して、画像の右側にあるトグル拡張モジュールボタンを特定し、それをクリックします。ラベル付けのドロップダウンメニューを選択します。接続された 2 つのラベル付けを選択します。

新しいタスクバーが表示されます。セグメンテーションレシピから初期マスクを取得し、入力ボックスにドラッグします。バーに入力マスク番号が表示されます。

入力マスク番号のアイコンをマスクゼロアイコンにドラッグします。タスクバーで最小サイズを見つけ、関心のある領域のみが表示されるまで数値を調整します。各フィッティング試行の必ず実行をクリックしてください。

最小サイズ調整が満足のいくものになったら、画面下部にある前の拡張レシピをクリックし、[レシピに保存]を選択します。ソフトウェアは、選択したレシピを上書きし、はいスポットを選択するように求めます。スポットチェックセグメンテーションと同じ手順でエンハンスメントレシピを確認します。

セグメンテーションと拡張のレシピに問題がなければ、測定テンプレートの作成に進みます。選択を開始するには、右側のツールバーで測定テンプレートを作成します。測定ウィンドウで、クリップアートセル図の上にカーソルを移動を選択します。

コントロールキーを押しながら、形態セクションの下のセルを選択し、デフォルトパラメータのチェックを外してエリアパラメータを確認します。次に、テンプレート ウィンドウを終了します。アイコンを選択します。

測定レシピを作成します。レシピの名前を変更します。テンプレートタブに移動して選択 右上隅にある、以前に作成した測定テンプレートを測定ウィンドウにドラッグアンドドロップします。

「はい」をクリックして測定レシピウィンドウを続行し、チャネルマッピングを選択します。次に、セル全体でマスク マッピングを選択します。次に、全セルオプションを選択します 拡張マスクの場合は、レシピタブで測定レシピを選択します。

メインウィンドウで、測定レシピウィンドウ内の保存アイコンを選択します。次に、ウィンドウを閉じます 次に、視野を閉じてから再度開きます。レシピリストフォルダを右クリックし、新しいをクリックして、必要なアプリケーションの順にレシピをレシピリストにドラッグし、レシピリストのロックを選択して、Adobe Photoshopを使用してビデオデータでレシピを順番に実行します。

同じコロニーの20フレームごとに分析されました。Adobe Photoshopでコロニー画像のフレームを手動で開きます。ツールバーの魔法の杖ツールをクリックします。

コロニーの周辺エリアをクリックすると、コロニーの地域を除くフィールド全体がカバーされます。コロニーの周りの点線がコロニーの内側ではなく、コロニーの周囲にぴったりと収まっていることを確認してください。点線が周辺を囲んでいない場合は、それに応じて上部ツールバーの許容値を変更します。

ツールバーのクイックマスクモードで編集をクリックし、コロニーをクリックしてコロニーを選択します。ウィンドウに移動し、プルダウンメニューをクリックしてヒストグラムをクリックします。キャッシュは 1 に設定する必要があります。

キャッシュが 2 つの場合は、エクスプレッション マークの感嘆符をクリックして、キャッシュを 1 に変更します。ピクセル値をスプレッドシートに記録します。20フレームごとに上記のプロセスを繰り返します。

その後、PhotoshopとCLクオンツソフトウェアを使用して収集したデータを一緒にプロットできます。HESCコロニーの成長を定量化するための私たちのプロトコルは、生物学的問題に対するビデオバイオインフォマティクスの1つの応用を示しています。ここでは、CLクオンツソフトウェアとadobe Photoshopを使用して決定した48時間にわたるコロニーサイズの増加を比較したグラフを示します。

グラフは、両方のソフトウェアパッケージによって分析された5つの異なるコロニーを示しています。各コロニーは異なる色で表されます。実線はセイルクオンツソフトウェアを使用して導き出され、点線はPhotoshopを使用して収集されました。

生データのグラフは、両方の測定方法が、コロニーの開始サイズが異なるという事実を説明するためによく一致していることを示しています。この図は、コロニーサイズの増加率として再プロットされたデータを示しています。成長率は開始コロニーのサイズに関係なく類似しており、両方の分析尺度で同様の結果が得られます。

次のグラフは、HESC コロニーの成長に関する以前の変化率データの平均を示しています。このグラフは、ビデオバイオインフォマティクスとAdobe Photoshopを使用して行われた分析との間に良好な一致が明確に示されています。ビデオバイオインフォマティクスツールを使用して、ヒト胚性幹細胞コロニーの成長を測定する方法を紹介しました。

位相差顕微鏡を使用してこの手順を実行するときは、ソフトウェアによる正確なコロニー選択のために、コロニーの周囲にハローを必ず含めてください。また、私たちが示したプロトコルの代わりに、培養、インキュベーション、ビデオ収集のための他の方法を使用できることを覚えておくことも重要です。レシピが開発され、検証されると、手動分析よりもはるかに迅速に、実験のばらつきが少なくて済むようになります。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。