Name: ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: 学ぶビデオバイオインフォマティクスを用いたヒト胚性幹細胞コロニー成長の自動解析法。タイムラプス映像のセグメンテーションと計測により、幹細胞生物学研究の効率化に貢献します。

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この方法の開発は、カリフォルニア州のたばこ関連疾患の研究プログラム、再生医療のためのカリフォルニア工科大学、およびUCR（でビデオバイオインフォマティクスに関するNSF IGERT助成金（＃0903667）からの資金調達によって可能となった<a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.phpを</a> ）。サブリナリンが大学院課から博士論文のフェローシップでサポートされている、ショーンFortenoはNIH MARCフェローシップでサポートされており、Shruthiサティは大学院課のフェローシップでサポートされています。我々は数字を準備する彼女の助けのためのアンナTrtchounianに感謝しています。我々はまた、CL -クワントソフトウェアを使用する方法を私達に教えるためにサムAlworthとネッドJastrombに感謝。

その1：実験方法ビデオデータは、情報の豊富さが含まれています。しかし、この情報は頻繁に抽出することは困難であると人間が手作業で行われ、完了するスタッフの時間の多くの時間を必要とする可能性がある場合。人間による手動の分析はまた、解釈し、エラーの変化の対象となります。ビデオバイオインフォマティクスは、ビデオ画像から特定のデータをマイニングするためのコンピュータソフトウェアの使用を含む。分析のこの方法は迅速であり、分析は人間が手作業で行われている場合に発生するエラーを排除することができます。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を定量化する方法を示すことです。 本論文では、時間経過のビデオ画像は、細胞の複数のフィールドが（図1）時間をかけて撮像を可能にするニコンBioStation CTのインキュベーションのユニットを使用して収集した。このレポートで説明されている方法は、設定微細な任意のビデオによって収集された映像データに適用可能である。 48時間、12ウェル組織培養プレートでH9 hESCの我々の実験デザインで、私たちはメッキ。このインターバルの間に、コロニーを完全に接続し、マトリゲル上に展開させた。その後、添付されたヒトES細胞のコロニーとプレートBioStation CTに転送し、さらに48時間インキュベートした。 BioStationにしながら、コロニーの画像は7分間隔で採取し、後でタイムラプスビデオシーケンスを作成するために使用されていました。各コロニーのためのビデオは、CL -クワントソフトウェアで開発したビデオバイオインフォマティクスのレシピを使用してコロニーの成長を定量化するために分析した。 CL -クワントソフトウェアで作成されたレシピを使用して行う分析は、手動でAdobe Photoshopを使用して真実性について調べた。 パート2：添付されたヒトES細胞のコロニーの準備<ol><li>マトリゲルでコートした6ウェルプレートにヒトES細胞の成長、そして一度、70％コンフルエントに達すると、次のように12ウェルマトリゲルコーティングしたプレートの5ウエルに6ウェルプレートの1つのウェルをreplate。 </li><li>よく含まれているヒトES細胞から培地を吸引除去する。 </li><li> PBS 1mlのと2倍よくすすいでください。 </li><li> 37℃および5％CO 2を 1分間Accutaseとインキュベートの1ミリリットルを追加。 </li><li>ウェルに10月12日ガラスビーズを追加し、コロニーは完全にウェルの底からデタッチされるまで静かにプレートを振る。 </li><li> mTeSR培地またはMEF馴化培地1mlを使用してAccutaseを中和する。 </li><li> 3分間200グラムで15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を遠心してください。 </li><li>新鮮mTeSR媒体の500μLで上清とブレークペレットをデカント。 </li><li> 12ウェルプレートの各ウェルにhESCのサスペンションのプレートの滴下100μlの。 </li><li>ロックプレートは前後に軽くし、光学顕微鏡下での文化を観察。細胞塊は均等にプレート全体に分散されていることを確認します。 </li><li>バックインキュベーターに12ウェルプレートを置きます。 </li><li>ヒトES細胞を48時間装着し、成長することができます（より短い時間を使用することができる）。 </li><li> 48時間後、培地をデカントし、アタッチされていない細胞を除去するためにPBSの500ulでウェルを洗浄。 </li><li>各ウェルにmTeSRの培地を1mlを追加。 </li><li>コメント：直ちにインキュベーター/ビデオイメージングのための顕微鏡にプレートを置く。 </li><li>タイムラプス画像の収集を開始。他のコロニーに成長する可能性がない離散単一のコロニーを持つフィールドを選択しよう。 </li><li>培養してヒトES細胞をセットアップするための他の方法は、上記のプロトコルの代わりに使用することができます。 </li></ol>パート3：ビデオバイオインフォマティクス CL -クワントのソフトウェアは、順番に実行するときに時間をかけて各コロニーに対してミクロンのピクセル数または領域を決定する三つの"レシピ"を作成するために使用されました。 3つのレシピは順番に、このアプリケーション用に構築されているセグメンテーション、強化、および測定を含む。 CL -クワントソフトウェア/レシピの開発を使用してhESCのコロニーの成長の分析： <ol><li> セグメンテーションのレシピが最初に作成されます。 </li><li>ビデオが使用可能であることを確認してビデオ全体をスキャンします。コロニー全体が視野に残っていると他のコロニーはフィールドを入力しないことを確かめるためにチェックします。 </li><li>セグメンテーションウィザードを開き、"次へ"ボタンをクリックしてください。 </li><li>正しいイメージのチャンネルを（すなわち、位相、緑、赤、など）を選択し、"次へ"ボタンをクリックしてください。 </li><li> 3つの選択肢のうち"ソフトなマッチング"を選択し、"次"をクリックします。 </li><li>一般的に画像コロニーの中央部に植民地の外縁上の領域を周回することによって"希望"の領域を選択します。 <ul><li>この領域はできるだけ小さくする必要がありますが、全体の植民地の代表です。 </li><li>位相差顕微鏡を使用する場合、ソフトによって正確なコロニーを選択するためのコロニーの周囲にハローを含めるようにしてください。 </li><li>異なる表示される場合があります関心の1または2の地域を選ぶピクセルは、コロニー内のパターンが、不正確なマスクのアプリケーションにつながる可能性が多すぎる"欲求"を選択しないでください。 </li></ul></li><li> "次へ"ボタンをクリックします。 </li><li>植民地ではなく背景の部分の一部ではない画像上の領域を周回することで地域を"希望しない"を選択します。これらはあなたが抑制し、そのような残骸や死細胞などのアーティファクトのピクセルを含むようにしたいパターンを持っている領域です。 "次"をクリックします。 </li><li>あなたが抑制したい領域を周回することで"背景"を選択します。 <ul><li> "したくない"と"背景"地域がそのバックグラウンドが異なる均一とすべてのフレームに表示する可能性が高いはずです。 </li><li>一般的に我々は、コロニーの周りの灰色の背景を選択します。 </li></ul></li><li> "次へ"ボタンをクリックします。 </li><li>色付きのマスクは、興味のある領域（図2A）上に表示されるべきである。 </li><li>マスクは、正確に興味のある領域をカバーしていない場合、セグメントのしきい値の範囲は、（ソフトウェアの画面の右下にある）に増加または減少させることもできます。 </li><li>必要に応じて、セグメンテーションウィザードはさらにマスク領域を微調整するプロンプトが表示されます。 </li><li>あなたがマスクを変更したい場合、"ソフトのマッチング領域を更新する"を選択します。これは、"したくない"、"する"、または"背景"の領域を変更することができます。 </li><li>マスクが十分な場合には、"しきい値を適用し、私のマスクを保存"を選択し、"次へ"ボタンをクリックしてください。 </li><li>マスクは、異なる色で表示されます。 </li><li> "フィニッシュ"を選択します。 </li><li>レシピは、ソフトウェアの右上隅に表示されるべきである、そしてそれが"セグメンテーションのレシピ"と呼ばれるべきものです。 </li><li>あなたが右クリックし"名前の変更"で希望の場合レシピの名前を変更します。 </li><li>スポットチェック用に、右クリックし、"レシピを適用"の上にマウスを置きます。 </li><li>メニューでは、スポットのレシピをチェックするときに使用したいフレーム数を選択できるようにすることが表示されます。マスクの位置の精度を確認発見するごとに10フレームのためのレシピを実行します。 </li><li>マスクは、小さな不要な領域または破片の部分をピックアップすると、関心の領域にマスクのフィッティングを改善するために"強化のレシピ"を作成することができます。 </li><li> 強化のレシピを作成するには、右の"強化のレシピ"フォルダをクリックし、"新しい"をクリックしてください。新しい拡張のレシピが表示されるはずです。 </li><li>視野（FOV）の元のフィールドから、画像の右側にある"トグルの拡張モジュール"ボタンをクリックしてください。正しいものを識別するために、ツールバーのアイコン上にマウスを移動します。 </li><li> "ラベル表示"ドロップダウンメニューを選択してください。 </li><li> "ラベリング4接続"を選択します。 </li><li> "ラベリング4 connected2"を選択します。 </li><li>新しいタスクバーが表示されるはずです。 </li><li>セグメンテーションのレシピから、初期マスク（mask0）を取得し、"入力"ボックスにドラッグします。 </li><li>バーが"＃入力のマスクを"表示する必要があります。 </li><li>マスク0アイコンに"＃入力マスク"でアイコンをドラッグします。 </li><li>タスクバーの"最小サイズ"を見つけ、関心領域のみが表示されるまで数を調整します。あなたが各継手の試験を通じて、"実行"をクリックすることを確認してください。 </li><li>一旦あなたがあなたの最小サイズの調整に満足している、以前に作成した"強化のレシピ"をクリックしてください。 （図2B） </li><li>画面の下部に、"レシピに保存"を選択します。 </li><li>ソフトウェアは、現在"選択されたレシピを上書き？"、"はい"を選択するプロンプトが表示されます</li><li>スポットチェックするセグメンテーションのため上記と同じ手順を使用して強化のレシピをチェック見つける。 </li><li>セグメンテーションと強化のレシピに満足している場合、右側のツールバーにある" 測定のテンプレートを作成"を選択します。 </li><li>必要に応じてするテンプレートの名前を変更します。 </li><li>測定のテンプレート]ウィンドウで、クリップアートのセルの数字の上にカーソルを移動します。 Ctrlキーを押しながらセルを選択します。 </li><li>チェックを外して"デフォルトパラメータ"と"形態"の下のチェック"の領域のパラメータ'。 </li><li> "テンプレート"ウィンドウを終了します。 </li><li>測定のレシピで作成されたアイコンを選択します。 </li><li>レシピの名前を変更します。 </li><li>に移動し、右上隅にある"テンプレート"タブを選択します。 </li><li>ドラッグして、測定ウィンドウにドラッグして、以前に作成した測定テンプレートをドロップします。 </li><li>続行するには"はい"をクリックします。 </li><li>測定レシピ]ウィンドウで、選択して"全細胞"、"チャンネルマッピング"。 </li><li> SELECT'マスクのマッピング"。 </li><li>その後、強化されたマスクのための"全セルのオプションを選択します。 </li><li>メインウィンドウでレシピのタブの下にある"測定レシピ"を選択してください。 </li><li>測定レシピのウィンドウ内の"Save"アイコンを選択してください。 </li><li>その後、ウィンドウを閉じます。 </li><li>今、"FOV"を閉じて開き直します。 </li><li>右の"レシピ"アイコンを選択"ロックのレシピのリスト"をクリックしてビデオデータを順番にレシピを実行する。 </li></ol>パート4：Photoshopのソフトウェアを使用して、レシピの正確さの確認 （CL -クワントソフで作成されたレシピを検証するために）は、同じデータをAdobe Photoshopで手動で解析することができます。この分析では、10回ごとのフレーム（毎70分の時点で）48時間以上のコロニーの大きさを測定するために分析した。 <ol><li> Adobe Photoshopでコロニーの画像のフレームを開きます。 </li><li>ツールバーにある魔法の杖ツールをクリックしてください。 </li><li>フィールド全体が植民地の地域を除いて覆われているように植民地の周辺をクリックしてください。 </li><li>ツールバーの"はクイックマスクモードで編集"とコロニーが選択されているように植民地をクリックします。 </li><li>コロニーの周囲に点線のラインは、コロニーの周辺部とではない、その中に右に収まることを確認してください。点線が周囲にない場合は、それに応じて上部のツールバーに許容値を変更します。 </li><li>メニューをプルダウンし、"ヒストグラム"をクリック"ウィンドウ"に移動します。 </li><li>ときにキャッシュ= 1ピクセルの値を書き留めます。キャッシュが2の場合は、クリックに'！'キャッシュを1に変更してから、ピクセルの値をメモする。 </li><li> 10回ごとのフレームのため、上記プロセスを繰り返します。必要に応じて、より少ない合計フレームを使用することができます。 </li><li> PhotoshopとCL -クワントソフトウェアを使用して収集されたデータは、一緒にプロットすることができます。 CL -クワントレシピが真実なら、PhotoshopとCL -クワント分析のための曲線は（図3-5）非常に似ている必要があります。 </li><li> CL -クワントで開発したレシピが真実なら、彼らは確実に他のビデオデータに適用することができます。 </li><li>この分析でビデオバイオインフォマティクスを使っての値は、セグメンテーション、強化、および測定のレシピを開発し、検証されれば、彼らははるかに急速に、より正確にPhotoshopを使用して、人間よりも解析が実行されるためです。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：BioStation CTでの成長の48時間の間にさまざまなタイミングでフレームを示すhESCのコロニーのフィルムストリップ。フレームは、7分間隔で採取された。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：セグメンテーションのレシピによって植民地に置かれたマスクを使ってヒトES細胞の（A）イメージ。破片と背景の領域も強化レシピが評価の精度を向上させるために必要とされることを示すマスクされています。 （B）増強後の"A"に示すように、同じコロニーのイメージが実行されています。マスクは今だけ植民地を選択し、ノイズは選択から除外されています。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：CL -クワントソフトウェアとPhotoshopを使用して決定されるように48時間以上（ピクセル単位）コロニーの大きさの増加を示すグラフ。このグラフはコロニーがさまざまなサイズで起動することを生データとを示している。また、測定の両方の方法がよく一致していることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：48時間以上のコロニーの大きさのパーセントの増加を示すために正規化した後、図3と同じデータを示すグラフ。これは成長率に関係なく開始コロニーの大きさのと分析の両方の対策が同様の結果がでてくるような似ていることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：図4の正規化されたデータのための手段を示すグラフ。このグラフは明らかにビデオバイオインフォマティクス（CL -クワントソフト）とPhotoshopを使用して、レシピが真実であることを確立行う分析の間に良い一致を示しています。フレーム325のPhotoshopデータの領域のわずかな悪化は、Photoshopの分析に含まれていないいくつかの動画によるものです。

ビデオバイオインフォマティクスのツールは、急速にビデオ画像からデータを抽出するために強力です。ヒトES細胞のコロニーの成長を定量化するための我々のプロトコルは、生物学的問題にビデオバイオインフォマティクスのあるアプリケーションを示しています。この方法は定量的であり、個々のヒトES細胞のコロニーからのデータを明らかにする興味深い機能を備えています。ビデオバイオインフォマティクスのレシピは、増殖、遊走、アポトーシス、および基板への細胞接着、および隣接するセルにセルの添付ファイルとして他の細胞プロセスを監視するために開発することができます。 CL -クワントソフトウェアを使用して開発されたレシピの精度は、Photoshopを使用して検証され、真実であることがわかった。適切なレシピが開発されたら、任意のソースからビデオデータは非常に迅速に分析することができます。ビデオバイオインフォマティクスのツールを使用してビデオデータを分析するために必要な時間は、Photoshopを使用して手動で実行する解析のために必要な時間よりも大幅に少なくなります。分析を行う人間が画像を分析されるたびにエラーやわずかに異なる判断を下すかもしれないが、コンピュータが、同じ...

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 ヒト胚性幹細胞維持培地</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05850</td><td>またはhESC培養に適した任意の培地。</td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>またはその他の適切な基質。</td></tr><tr><td>DMEM/F12 基本培地</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;および Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;不含リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase 酵素細胞剥離培地</td><td>eBioscience</td><td>00-4555-56</td><td>またはその他の適切な剥離酵素。</td></tr><tr><td>3mm ガラスビーズ</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>オプション。</td></tr><tr><td>12ウェル組織培養プレート</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td>またはその他のプレート形式。</td></tr><tr><td>Nikon BioStation CT/IM</td><td></td><td></td><td>またはビデオデータ収集に適したその他のインキュベーター/顕微鏡。</td></tr><tr><td>CL-Quant ソフトウェア (Nikon) および/または Photoshop (Adobe)。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

ビデオデータは複雑であり、多くの画像、ビデオ素材からマイニング情報で構成されているため、コンピュータソフトウェアの助けなしに行うことは困難です。ビデオバイオインフォマティクスは、デートマイニングと分析を実行するコンピュータソフトウェアを使用してビデオ画像からの時空間データを抽出するための強力な定量的なアプローチです。この記事では、我々には、ビデオ画像のためのカメラを搭載したニコンBioStation CTインキュベーターで収集したタイムラプスビデオを分析することにより、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）の成長を定量化するためのビデオバイオインフォマティクスの手法を紹介する。我々の実験では、マトリゲルにアタッチされていたヒトES細胞のコロニーは、BioStation CTで48時間撮影されました。これらのコロニーの成長率を決定するために、レシピは、ユーザーがビデオ画像からのデータの様々なタイプを抽出することができるCL -クワントソフトウェアを使用して開発されました。正確にコロニーの成長を評価するために、3つのレシピを作成しました。植民地と背景、正確にビデオシーケンス全体にコロニーを定義する2番目の拡張像、およびサードへの最初のセグメント化された画像は、時間をかけて植民地でピクセル数を測定した。 3つのレシピが48時間にわたって個々のヒトES細胞のコロニーの成長率を分析するBioStation CTで収集した映像データを順番に実行されました。 CL -クワントレシピの真実性を確認するには、同じデータをAdobe Photoshopソフトウェアを使用して手動で分析した。データは、CL -クワントのレシピを用いて得られたし、Photoshopを比較したところ、結果はCL -クワントレシピが真実であったことを示す、実質的に同一であった。ここで説明する方法は、ヒトES細胞やコロニーに成長する他の細胞の増殖率を測定するために任意のビデオデータに適用することができる。さらに、他のビデオバイオインフォマティクスのレシピは、マイグレーション、アポトーシス、および細胞接着などの他の細胞プロセスのための将来的に開発することができます。

ビデオバイオインフォマティクスは、自動処理、分析、理解、および顕微鏡ビデオから抽出した生物学的な時空間データのデータマイニングです。この記事の目的は、ビデオバイオインフォマティクスの手法を用いて、ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長を測定するための方法を示すことです。

ビデオデータは複雑であり、多くの画像で構成されているため、コンピュータの支援なしにビデオ資料から情報をマイニングすることは困難です。

本プロトコルでは、ビデオイメージング用カメラを搭載したicon bio station CTインキュベーターで収集されたタイムラプスビデオを解析し、ヒト胚性幹細胞コロニーの増殖を測定するビデオバイオインフォマティクス法について解説します。ヒト胚性幹細胞（HESC）コロニーをコンフルエンシー70%まで培養して再播種し、48時間インキュベートした後、Biot ctを用いてさらに48時間、HESCコロニーを撮影します。増殖率は、CL quantソフトウェアで開発されたセグメンテーション強調および測定レシピを用いて決定します。これらのレシピは、各コロニーに対して精密な手動マスクフィッティングが可能な画像解析ツールであるAdobe Photoshopとの比較によって検証されています。ビデオバイオインフォマティクスという新興分野を利用することで、顕微鏡ビデオからの生物学的データの処理、解析、およびマイニングを自動化することが可能です。こんにちは、カリフォルニア大学リバーサイド校の細胞生物学および神経科学科、Prou Talbot博士の研究室のSerena Linです。こんにちは。Talbot LabのSean Finoです。こんにちは。細胞分子・発生生物学大学院プログラムのTI Satishです。本日は、ビデオバイオインフォマティクスツールを用いてヒト胚性幹細胞コロニーの成長を測定する方法について解説します。当研究室では、環境毒性物質がヒト胚性幹細胞の挙動に及ぼす影響を測定するためにこの手順を用いています。今回は、新設された幹細胞コアファシリティにてこの手順を実演します。それでは、始めていきましょう。ビデオ解析用にHESCを準備するには、HESCをMatrigelコートした6ウェルプレートでコンフルエンシーが70%になるまで培養します。HESCを含む1つのウェルから培地を吸引し、1 mLのPBSで2回洗浄します。1 mLのAccutaneを加え、37 °C、5% CO2条件下で1分間インキュベートします。次に、ウェルに10〜12個のガラスビーズを加え、コロニーが完全に剥離するまでプレートを穏やかに振盪します。1 mLのヒト胚性幹細胞維持培地またはマウス胚性線維芽細胞馴化培地を用いてAccutaneを中和します。ビーズを含まない剥離細胞を15 mLコニカルチューブに回収し、200 Gで3分間遠心分離します。上清を捨て、500 µLの新鮮なヒト胚性幹細胞維持培地またはM-T-E-S-Rでペレットを再懸濁します。HESC懸濁液100 µLを、Matrigelでコーティングした12ウェルプレートの各ウェルに滴下します。プレートをゆっくりと前後に揺らし、光学顕微鏡下で培養細胞を観察して、細胞塊がウェル全体に均等に分布していることを確認します。プレートを37°C、5% CO₂のインキュベーターに48時間置き、細胞が平らに接着し、容易に視認できる大きさになるようにします。48時間後、培地を吸引し、500 µLのPBSでウェルを洗浄して未接着細胞を除去した後、各ウェルに500 µLのM-T-E-S-R培地を加えます。直ちにプレートをBiot CTに設置し、タイムラプス画像の撮影を開始します。他のコロニーに接触して成長する可能性が低い、独立した単一コロニーのある視野を選択するようにしてください。本プロトコルでは、7分間隔でフレームを撮影し、さらに48時間にわたって細胞をビデオ記録します。セグメンテーションレシピを作成するために、まずビデオ全体を手動でスキャンし、録画期間中ずっとフォーカスが合った単一のコロニーが含まれていることを確認します。その後、CL quantsソフトウェアのセグメンテーションウィザードを開き、Nextボタンをクリックします。正しいイメージチャンネルを選択し、Nextボタンをクリックします。「soft matching」を選択し、「Next」をクリックします。コロニーの外縁から中心領域に向かって円を描くようにし、1つまたは2つの関心領域（want regions）を選択します。この領域は可能な限り小さく、かつコロニー全体を代表するものである必要があります。領域を多く選びすぎると、マスクの適用が不正確になる可能性があるため注意してください。「次へ」ボタンをクリックします。コロニーの一部ではなく、かつ背景の一部でもない領域を囲み、「領域として除外」を選択してください。これらの領域には、デブリや死細胞など、抑制すべきパターンが含まれています。「次へ」をクリックしてください。コロニー、デブリ、または死細胞ではない領域を囲んで、背景を選択します。背景は均一で、すべてのフレームに現れる可能性が高いものである必要があります。通常は、コロニー周囲のグレーの背景を選択します。「次へ」ボタンをクリックしてください。マスクが関心領域を正確にカバーしていない場合は、関心領域の上にカラーマスクが表示されます。マスクの変更が必要な場合は、画面右下のセグメンテーションしきい値範囲を増減させてください。「updates soft matching regions」を選択します。これにより、「想要（want）」、「不要（don't want）」、または背景領域を変更できます。マスクに問題がなければ、「apply threshold（しきい値を適用）」を選択し、「save my mask（マスクを保存）」をクリックします。その後、「next」ボタンをクリックしてください。すると、マスクが別の色で表示されます。「finish」を選択してください。ソフトウェアの右上に、セグメンテーションレシピとしてレシピが表示されるはずです。必要に応じて、右クリックして新しい名前を入力し、レシピの名前を変更してください。レシピを適用するには、右クリックしてマウスを重ねます。レシピを適用します。使用するフレーム数を選択するメニューが表示されます。マスクの忠実度を確保するため、フレーム間隔を20フレームごとに設定してください。マスクを適用したフレームの10%をランダムに手動でスポットチェックし、デブリ内の不要な領域を除去するためのエンハンスメントレシピを作成します。エンハンスメントレシピフォルダを右クリックし、「新規作成」をクリックします。元の視野から新しいエンハンスメントレシピが表示されます。ツールバーのアイコンにマウスを合わせ、画像の右側にあるエンハンスメントモジュール切り替えボタンを確認してクリックします。ラベル付けのドロップダウンメニューを選択し、「connected」のラベル付けを選択し、続いて「connected two」のラベル付けを選択します。新しいタスクバーが表示されます。セグメンテーションレシピから初期マスクを取得し、入力ボックスにドラッグします。これにより、バーに入力マスク番号が表示されます。入力マスク番号のアイコンをマスク0のアイコンまでドラッグします。タスクバーで最小サイズ（min size）を確認し、関心領域のみが表示されるまで数値を調整してください。各フィッティング試行ごとに、必ず「execute」をクリックしてください。最小サイズの調整に満足したら、画面下の前の増感レシピをクリックし、レシピに保存を選択します。ソフトウェアから選択したレシピを上書きするかどうかを確認されるので、「はい」を選択します。スポットチェックのセグメンテーションと同様の手順で、増感レシピを確認してください。セグメンテーションおよび強調処理のレシピに満足した場合は、続いて測定テンプレートの作成に進みます。まず、右側のツールバーから「create measurement template（測定テンプレートの作成）」を選択します。測定ウィンドウ内で、「move cursor（カーソルの移動）」を選択し、クリップアートの細胞図の上に配置します。Ctrlキーを押しながら「morphology」セクションの下にあるセルを選択し、「default parameter」のチェックを外して「area parameter」にチェックを入れます。その後、テンプレートウィンドウを閉じます。アイコンを選択してください。測定レシピを作成します。レシピの名前を変更します。「テンプレート」タブに移動し、それを選択します。右上のコーナーから、 previously 作成した測定テンプレートを測定ウィンドウにドラッグ＆ドロップします。測定レシピウィンドウで「はい」をクリックして続行し、チャンネルマッピングを選択します。次に、全細胞選択マスクマッピングを選択します。続いて、全細胞オプションを選択します。拡張マスクを使用する場合は、レシピタブの下にある測定レシピを選択してください。メインウィンドウで、測定レシピウィンドウ内の保存アイコンを選択します。その後、ウィンドウを閉じます。次に、視野を閉じてから再度開きます。レシピリストフォルダを右クリックして「新規」をクリックし、必要な適用順にレシピをレシピリストにドラッグして、「レシピリストをロック」を選択し、Adobe Photoshopを用いてビデオデータにレシピを順次実行します。同一コロニーの20フレームごとに解析を行いました。Adobe Photoshopでコロニー画像のフレームを手動で開きます。ツールバーの自動選択ツールをクリックします。コロニー周辺の領域をクリックし、コロニー領域以外の視野全体がカバーされるようにします。コロニーを囲む点線が、コロニーの内部ではなく、その外周にちょうどフィットしていることを確認してください。点線が外周に沿っていない場合は、上部ツールバーの許容値（tolerance value）を適宜変更してください。ツールバーのクイックマスクモードにある「edit」をクリックし、コロニーをクリックして選択します。「window」のプルダウンメニューに移動し、「histogram」をクリックします。キャッシュは1に設定してください。キャッシュが2である場合は、感嘆符の式マークをクリックしてキャッシュを1に変更します。ピクセル値をスプレッドシートに記録してください。以上の工程を20フレームごとに繰り返します。PhotoshopおよびCL quantソフトウェアを用いて収集したデータを、まとめてプロットすることが可能です。HESCコロニー増殖を定量化する本プロトコルは、生物学的な課題に対するビデオバイオインフォマティクスの応用例の一つを示しています。ここでは、CL quantソフトウェアとAdobe Photoshopを用いて算出した、48時間におけるコロニーサイズの増加を比較したグラフを示します。グラフは、2つのソフトウェアパッケージでそれぞれ解析した5つの異なるコロニーを示しています。各コロニーは異なる色で表されています。実線はsail quantソフトウェアを用いて導出され、点線はPhotoshopを用いて収集されました。生データのグラフから、コロニーの初期サイズが異なるという事実を考慮しても、両方の測定方法が良好に一致していることがわかります。この図は、コロニーサイズの増加率（％）として再プロットしたデータを示しています。増殖率は初期のコロニーサイズに関わらず同様であり、どちらの分析手法でも同様の結果が得られています。以下のグラフは、HESCコロニー増殖に関する前述のパーセント変化データの平均値を示しています。このグラフから、ビデオバイオインフォマティクスを用いて行われた解析とAdobe Photoshopを用いて行われた解析の間で、良好な一致が見られることが明確に分かります。以上で、ビデオバイオインフォマティクスツールを用いてヒト胚性幹細胞コロニーの増殖を測定する方法について説明しました。位相差顕微鏡を用いてこの手順を行う際は、ソフトウェアによる正確なコロニー選択のため、コロニー周囲のハロー（光輪）を必ず含めるようにしてください。また、本プロトコルで示した方法以外に、培養、インキュベーション、およびビデオ収集のための他の手法を代用できることも重要です。レシピが開発および検証されれば、手動分析よりもはるかに迅速に、かつ実験的なばらつきを抑えて分析を行うことが可能になります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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この研究で提示されたプロトコルは、フローサイトメトリー分析を使用して、正および負の多能性幹細胞マーカーの動的測定によって再プログラミングの進行をリアルタイムでモニタリングするための方法を記載しています。プロトコルは、IPSCの生成時形態、およびマーカーまたはレポーター発現のイメージングに基づく評価を含みます。...

体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

始原生殖細胞 (PGCs) 精子と卵の両方の共通の前駆体であります。人間の胚の始原生殖は、サイトカインとの相互作用を通じて多能性胚盤葉上層の細胞から指定されます。ここでは、プライミング多能性誘導多能性幹細胞からの胚様体の表面で孵卵に似たひと細胞 transcriptomally を誘導する 13...

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。...

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。...

成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

ここでは、継代0のケラチノサイトの系統を手動で追跡するために使用できるライブセルイメージング解析の方法を提供し、細胞分裂の運命や細胞周期の持続時間などの増殖指標を収集できるようにします。...

表皮ケラチノサイト増殖動態を研究するためのタイムラプス写真によるライブセルイメージング

学ぶビデオバイオインフォマティクスを用いたヒト胚性幹細胞コロニー成長の自動解析法。タイムラプス映像のセグメンテーションと計測により、幹細胞生物学研究の効率化に貢献します。

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

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