磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

磁気変調バイオセンシング（Magnetic modulation BIOSENSING）またはMMBは、生物学的分子を検出するための新しい手法です。ここでは、抗IL-8抗体でコーティングされた磁気ビーズと蛍光標識ストレプトアビジンを含む反応混合物に、インターロイキン8（IL-8とも呼ばれる）を添加した際にIL-8を検出する原理証明アッセイを示します。これにより、蛍光分子を磁気ビーズに効果的に結合させる分子サンドイッチが形成されます。

反応液をキュベットに入れ、交互磁場に置きます。2つの電磁極を通じて勾配をかけることで、ビーズを振動運動させます。蛍光タンパク質が結合したビーズが直交レーザービームに出入りする周期的な運動により蛍光信号が発生し、これをPMTで収集して復調します。

ロックインアンプを使用し、PMTの代わりにCCDカメラを用いることで、ビーズの動きを可視化できます。磁気ビーズがIL-8を介して蛍光タンパク質に結合しているサンプルでは、同期した動きが観察されます。こんにちは、テルアビブ大学物理電子学部の非線形光学・レーザー研究室のAdiaです。シカゴ大学生物科学部のNoGoです。そして、テルアビブ大学の細胞研究・免疫学部から来たMarcelo Erlichです。

本日は、磁気変調バイオセンシングシステムを用いたバイオアッセイの迅速かつ均一な検出法をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて低濃度の特定のタンパク質およびDNA配列の検出を行っています。それでは始めていきましょう。

標的サンプルおよび非標的コントロールサンプルを含む、各反応用のチューブを準備し、ラベルを貼付することから本手順を開始します。各チューブに、Bio-Plex Precision Proサイトカインアッセイの以下のコンポーネントを順に加えます：カップリング磁気ビーズ、検出用IL-8抗体、ストレプトアビジンPE、およびIL-8標的。アッセイバッファーで液量を100 µLまで調整し、コンパクトオービタルシェーカーで30分間振盪します。

試料を室温で30分間振盪させた後、そのまま分析用キュベットに移します。MMBシステムのクリアキュベットを、レンズクリーニングティッシュと70% ethanolを用いて清掃します。分析に使用する装置は、励起光源として488 nanometerの波長倍増レーザーを使用し、562 nanometerのダイクロイックビームスプリッターを用いて顕微鏡対物レンズに導く構成となっています。

顕微鏡の対物レンズにより、レーザーを幅 400 µm の BO silicate ガラス管内の 27 µm のビームウエストに集光させます。放出光は、2枚のバンドパスフィルターを用いて連続的に分光フィルタリングされ、光電子増倍管（PMT）で検出され、ロックインアンプを用いてデモジュレーションされます。自作の電流モジュレーターを使用して、各電磁石に矩形波を順次供給します。

ビーズは1サイクルにつき2回レーザービームに出入りするため、振幅は1.4 amps、周波数は1〜6 hertzにする必要があります。ロックインアンプの復調周波数は2〜12 hertzです。488 nanometerレーザーのキーをオンにし、電源を入れることでシステムを起動します。

次に、レーザー出力を最小の約4〜6 milliwattsに設定します。オシロスコープの電源を入れ、続いてPMTの電源を入れます。次に、サンプルキュベットを2つの電磁極の間に設置します。

veteの回転ステージを使用して、レーザービームがveteを通過し、veteの壁に当たらないように調整します。veteのXYおよびZ translation stageを使用して、対物レンズおよび電磁極に対する位置を変更します。蛍光光の検出器への結合を最適化するために、veteは極ラインのわずかに後方に配置する必要があります。

次に、オシロスコープをタイムトレース測定に設定します。PMTゲインコントロールを0.5 Vに設定してください。続いて、電流変調器の電源を入れ、周波数を3 Hzに設定します。

ビーズの凝集と凝縮させるため、30秒間待機します。磁気ビーズが振動し始め、チューブの前方へ移動します。レーザー光が振動するビーズに当たると、ビーズから反射したレーザー光の点滅が確認できるはずです。

電流変調を大きくするとビーズの移動速度が上がり、小さくすると速度が低下することを確認してください。チューブ内におけるビーズの位置は、マイクロメーター制御ステージを用いて調整可能です。極方向へのビーズの移動は、PMTの代わりに配置したCCDカメラを用いて可視化することができます。

オシロスコープで蛍光結合ビーズからの周期的信号を検出し、オシロスコープの時間波形を記録します。保存されたデータはMATLABを用いて解析できます。IL8を含む反応混合液と含まない反応混合液をMMBでアッセイしました。ターゲットが存在するすべての反応において、ビーズは単一の高密度凝集体を形成し、レーザービームの中を同期して出入りしました。

しかし、標的がない場合、ビーズの凝集は少なく、その運動の連動性も低くなりました。ここで、黄色で示されたポール変調クロックとマゼンタで示されたPMT出力信号は、各ポールの変調周波数が2 Hzであることを示しています。したがって、復調周波数は理論的な期待通り4 Hzとなります。

ビーズがレーザービームを通過すると、PMTが蛍光を検出し、PMT信号と二重変調クロックがロックインアンプに送られることで、PMT出力電圧にピークが生じます。高感度な位相検出器が同期を行い、結果が高電圧として出力されます。2色の表示は、同一の標的濃度における2回の異なるスキャンを示しています。

黒線は各信号の平均を表しています。コントロールサンプルをテストした際、ロックインアンプは信号を検出しませんでした。このケースにおいて、ロックインアンプは同期信号を出力しませんでした。

この事実と凝集状態の視覚的な違いは、MMBシステムおよびPMT出力信号のタイムトレース測定の差によって、IL-8標的の存在を明確に特定できることを示唆しています。以上で、磁気変調を用いて生物学的分子を迅速かつ均一に検出する方法を、IL-8を例として説明しました。

この手順を行う際は、レーザー安全手順に従うことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。