Name: 脳室下帯恩顔：Wholemount染色と上衣の流れ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T16:22:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: 学ぶ脳室壁のホールマウント技術による神経発生研究。マウス脳を用いて脳脊髄液の流れと上衣細胞の動態を可視化し、成人脳の神経幹細胞挙動を解明する革新的な方法です。

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心室と脳室帯の神経発生のほとんどの研究は、これらの地域におけるミクロ解剖学と細胞の関係を調べるために古典的なセクショニングのテクニックに頼ってきた。ここでは、抗有糸分裂の治療6次のSVZの幹細胞集団の再生を研究するために使用された最初のSVZ 1で生成された神経芽細胞の遊走チェーンのネットワークを分析するために使用する別の方法を、、説明、および最近では正確な頂を研究するために使用と成体SVZの神経幹細胞2,3,4の基底細胞間の相互作用。興味深いことに、この手法は、成人SVZの神経幹細胞、またはタイプのB1細胞は、差別化された非分裂上衣細胞と混合した神経上皮の一部であることを明らかにした。 EN -顔のwholemountsを用いたイメージングでは、この混合神経上皮が上衣細胞の4大頂面に囲まタイプのB1細胞の頂端部のエンディングで構成される風車のアーキテクチャを持っていることを示しています。このエン顔分析は、血管ニッチに連絡心室表面における心尖部終末と基底のプロセスを持つ細胞で構成されるような胚と成体脳における神経幹細胞の系統の我々の理解を明確にしています。これらの知見は、古典的な切片の技術を使用して、ほぼ不可能だったろう。また、心室接触先端突起を介して神経幹細胞の識別を容易にWholemounts。これらの幹細胞が発見されたために、より特異的なマーカーとして、wholemountsは、神経幹細胞の振る舞い​​を識別し、分析の不可欠な部分となります。 側脳室の壁のWholemountsも上衣細胞の平面極性を研究するための理想的な視点を提供しています。上衣細胞は、協調的にCSFを推進するために機能する心室の内側を覆うmulticiliated細胞である。 wholemount手法では、全体の上衣上皮はen -顔を露出していると後部との背腹境界に染色し、その前から総合的に検討することができます。さらに、急性解剖、ライブwholemountsで実行上衣フローアッセイは、確実に上衣繊毛によって生成された平面偏光の流れを示しています。 wholemountアプローチを使用して最近の仕事は、この上衣平面極性5の細胞の決定要因を明らかにした。興味深いことに、wholemount研究はまた、上衣、生成されたCSFのフローは、SVZ 7の若い神経細胞の遊走を導くchemorepellentsの勾配を確立することを示唆している。当初は渡り鳥神経チェーンのネットワークを識別Wholemountアプローチはそのためチェーンの移行を調節する機構についての洞察を提供し続けている。 wholemountイメージングによるVZとSVZの分析は、両方とも今後の研究と既存研究の我々の理解を明確にする方法のための新しいアプローチが追加されます。例えば、最近の研究では、成人SVZにおける神経幹細胞が脳室8と接触してCD133 + / CD24 -細胞であることが示唆された。セクションでそれらの免疫染色に基づいて、これらの著者らは、これらの細胞はmulticiliated上衣細胞の亜集団であることを主張した。しかし、全体上衣上皮のより包括的なビューを与えるwholemountアプローチを、使用して私たちの研究で、我々はそのすべての上衣細胞はCD24とのみ心室接触CD133は+ / B1型のサブセットCD24 -であった細胞が見つかりました細胞4。さらに、wholemountテクニックは成人の脳9の神経幹細胞の最近記載されたモザイクの組織を調べ、今後の研究に有用であることを約束。いくつかの研究は、成体脳における神経幹細胞は均一な集団ではないことが示されているが、地域的に指定されており、通常は嗅球の介在ニューロンの特定のサブタイプを生成する。これらの研究は、神経幹細胞の異なる亜集団が特定の転写因子の発現10,11,12,13,14および/ ​​またはの背腹と前後のエクステントに沿ってそれらの局所的配置のいずれかによって区別される可能性があることを提案した側壁9,15,16。成体神経幹細胞の地域指定のサブポピュレーションのより多くの分子マーカーが同定されているとして、wholemountイメージングは​​、心室壁に沿ってこれらの異なる前駆細胞ドメインのparcelationの包括的なビューを提供する必要があります。 ここで提示wholemount解剖と画像化技術は、胚の心室壁を分析するために使用されることがあります。胚の外側の壁の解離についても同様に、ステップバイステップで、実行されます。難易度のわずかな違いがありますが、胚の心室は解剖が容易に比較的大きいですが、組織は、操作をより困難に柔らかいです。特に、側脳室の同様の暴露は、エンブリーで使用することができます。OSは、皮質神経発生を研究するために心室の皮質壁を細かく分析する。最近の証拠は、非対称中心体の継承は、皮質神経発生17中に心室の表面に放射状グリアを維持することを示唆している。放射状グリア頂面の専用バスの顔画像は、これらの分裂細胞内の中心体が非対称的にどのように継承されるかについての洞察を提供することがあります。 特にほとんどの技術、正確な器用さを伴うものと同様に、支配は練習が必要です。より良い結果への鍵となる解剖のいくつかの要素が、しかし、があります：1）照明は、影を作成するサンプルの照明を調整することのような鉗子を使用して）そうでなければ、2は比較的均質である組織の解剖中に貴重なコントラストを提供します。このテクニックの2つの昆虫ピン鉗子を一緒に挟んだり、組織をピックアップするために使用されることはありませんが、）、穏​​やかな収縮のバランス03を切断し、ナイフを切断いけないしながら組織を安定させるために継続的に再調整することができる機動性のピンとして使用されるのみカットするだけでなく、この解剖の大半は実際には断続切削で穏やかな収縮を介して実行されていることを思い出して、内側と外側の壁を分離するために穏やかな撤回を提供するために使用される。

脳室下帯恩顔：wholemount染色と上衣の流れ

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

側脳室の壁は、成体哺乳動物の脳の最大の胚の領域が含まれています。これらの壁の脳室下帯（SVZ）の神経幹細胞と成体のニューロン新生の制御の挙動を理解するための広範囲に研究のモデルシステムです。伝統的に、これらの研究は、組織学的分析のための古典的なセクショニングのテクニックに頼ってきた。ここでは、この胚地域の包括的な、EN -顔のビューを提供する代替的なアプローチ、wholemountテクニックを、提示する。セクションに比べて、wholemountsは完全な細胞構築とSVZ内の細胞の関係を維持する。このアプローチは、最近、大人の神経幹細胞、またはタイプのB1細胞は、側脳室の内側を覆う、分化上衣細胞と混合した神経上皮の一部であることを明らかにした。さらに、このアプローチは、彼らは脳室で生成上衣細胞と脳脊髄液の流れの平面偏光を研究するために使用されています。成体神経幹細胞は、地域的に指定されている不均一な集団であることが最近の証拠で、wholemountアプローチは、おそらくこの幹細胞のニッチの組織とparcellationを理解するために不可欠なツールとなります。

側脳室の壁は、成体哺乳動物の脳の最大の胚の領域が含まれています。伝統的に、この地域における神経新生の研究は、組織学的分析のための古典的なセクショニングのテクニックに頼ってきた。ここでは、この胚地域の包括的な、EN -顔のビューを提供する代替的なアプローチ、wholemountテクニックを、提示する。

脳室下帯恩顔：Wholemount染色と上衣の流れ

側脳室の壁には、成体哺乳類の脳において最大の神経新生領域が存在します。これらの壁に位置する脳室下帯（SVZ）は、...

こんにちは、Zamanです。そしてArturo Alvarezです。本日は、脳神経外科およびEli Edith Broad再生医学・幹細胞研究センターにあるArturoの研究室から、側脳室壁のホールマウント標本の作製方法をご紹介します。これらのホールマウント標本は、免疫染色のための固定標本として、あるいは脳脊髄液の流れを分析するための生細胞標本として利用可能です。本日Mannが実演するホールマウント法は、当研究室で長年かけて開発され、脳室側壁全体を研究するために最適化されたものであり、脈絡叢細胞および神経幹細胞が存在する脳室下帯の基底層における増殖能の解析が可能です。この手法はもともとFiona Dutchによって開発され、その後HIE VictorとCasu Motoによって完成されました。これらはすべて、現在はラボにありません。以下の図は、側脳室の外側壁のホールマウント標本を調製する方法を示しています。まず、脳を2つの半球に分割します。海馬と、ここに紫色で示されている断面を露出させるため、後方から冠状切開を行います。次に、海馬を覆い紫色で示されている内側壁を、stray aumを覆いピンク色で示されている外側壁から剥離します。2つの壁を本を開くように互いに広げ、内側壁を切り離すことで、外側壁を露出させます。このビデオの最初のセクションではホールマウント解剖について説明しますが、これが必ずしも最初のステップになるとは限りません。時系列として、ペナルフロー（penal flow）の解析を計画している場合は、詳細について書面によるプロトコルを参照してください。各解剖の前に、すべての器具が滅菌されており、すぐに使用できる状態にあることを確認してください。37 °CのL 15 leitz培地を入れた6 cmの解剖用ディッシュを蛍光解剖用実体顕微鏡の下に置き、摘出したばかりのマウス脳を実体顕微鏡下のディッシュに入れてください。微小鑷子を用いて、嗅球を剥離します。スタブナイフを使用して、脳を2つの半球に分割します。一方の半球の後端で冠状面に沿って切断します。海馬の背側を露出させて断面を作成するために、皮質と海馬の間の小さな脳室腔にstab knifeを挿入し、海馬に背側で接続している皮質を切断して切り離します。隅にある皮質を楔状に切り取り、微小鉗子を用いて海馬からゆっくりと剥がします。海馬の腹側縁まで巻き付いている皮質を、引き続き剥がしていきます。スタブナイフを使用して、海馬を皮質の腹側部分から切り離します。ナイフと微細ピンセットを用いて、海馬を皮質から後方へ退けます。脳室壁を傷つけないよう注意しながら、慎重に前方へ進めます。2つの壁を互いに外側へ開くようにします。ナイフで本を開くようにして、側壁に突き出した皮質部分を切り除きます。牽引に対する抵抗が増してこの表面の視認性が低下するため、さらに2箇所の切開を行う必要があります。内側壁と外側壁が接する背側の一箇所と、同様に腹側の一箇所を切開します。これらの切開には、スタブナイフを用いて小さく刻むように切ってください。これらの追加の切開により、内側壁をさらに牽引して、脳室の前方を露出させることができます。内側壁と外側壁の接合部が、2つの壁の間の谷のように影となって現れるよう、照明を調整します。ナイフを使用して、正確にその谷の部分で切断し、視床および突き出た皮質を除去します。ホールマウントは、直ちに脳室流解析に使用してください。免疫染色のためのホールマウント作成を行う場合は、作成後すぐに固定液に浸漬させることで、一度に多くのサンプルを処理することが可能です。ビデオの次のセクションでは、脳室細胞の繊毛によって生成される流体流のアッセイ方法を実演します。蛍光マイクロビーズの使用。新鮮に摘出した側壁孔融解物を、まず2本の昆虫ピンで解剖皿に固定します。次に、蛍光マイクロビーズを満たしたガラスマイクロピペットの先端をホールマウントの表面まで下げ、タイムラプス撮影を行いながら、表面に蛍光ビーズを緩やかに滴下します。ビデオには、アペンド流アッセイにおけるビーズの動きが記録されています。本プロトコルの記述部分に記載されている通り、ホールマウント解剖の前にガラスマイクロピペットを準備しておく必要があります。完成したピペットは、緩やかで浅いテーパーを持ち、内径が約100 micrometersで、45度のベベル形状である必要があります。毛細管現象を利用して、ピペットの約半分までミネラルオイルを満たします。真空グリースを塗布したプランジャーをピペットの背面に挿入します。次に、プランジャーを押し込み、オイルのメニスカスをピペットの先端まで移動させます。プランジャー付きピペットを、調節可能なアームに取り付けられたマイクロマニピュレーターで固定します。ピペットの先端に、50%蛍光マイクロビーズ、5%グリセロール、45%水の溶液を充填します。前述の方法に従ってホールマウント標本を新鮮に作製し、心室側を上にして、37 °Cに保たれた清潔な解剖皿へ移します。Leitz培地を用い、視床と前背側皮質に2本の昆虫ピンを刺して、ホールマウントを解剖皿に固定します。マイクロマニピュレーターを保持するステーションナリーアームの基部を実体顕微鏡の横に配置し、マイクロピペットの針を破損させないようアームを上げた状態に保持します。マイクロピペットの先端を培地が入ったチューブに浸し、先端の外側に付着したマイクロビーズを洗浄します。チップを折らないように注意してください。ピペットの先端を側壁の背側に合わせ、アームを下げてピペットの先端を組織表面の直上に配置します。ホールマウントの前半分を含む視野に焦点を合わせ、目的の画像の記録を開始します。プランジャーを使用して、約5 Lのマイクロビーズをホールマウント表面に放出します。最初のビーズの塊がペナルフローによって表面から除去された後、プランジャーを使用してさらに5 nLずつマイクロビーズを放出します。流れの方向と速度は、記録されたビデオを用いて分析できます。このビデオの最後のセクションでは、孔状マウント（hole mounts）の免疫染色を行い、共焦点イメージング用のスライドに封入する方法を実演します。まず、摘出した直後の孔状マウントを24ウェルプレートに移し、パラホルムアルデヒドに浸漬させて固定します。続いて、一次抗体、次いで蛍光標識二次抗体による一連のインキュベーションを行い、その間に洗浄工程を挟みます。染色後、全層標本を部分的に解剖し、脳室下帯を含む側壁の薄い層のみを、下層の層および皮質を含む全層標本の残りの部分から分離します。この薄く平らな組織片をスライドガラスに移し、カバーガラスをかけて、免疫染色のための全層標本を固定します。氷上の4%パラホルムアルデヒドおよび0.1%Triton X-100を含む24ウェルプレートを使用します。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、解剖したホールマウント試料を心室側を上にしてプレートの1ウェルの中に静かに浸します。試料を4°Cで一晩固定し、固定液を吸引除去した後、トランスファーピペットを用いて0.1% Triton X 103含有XPBSでホールマウントを3回、各5分間慎重に洗浄します。すべての液体操作において、ホールマウントの反転や組織の損傷を防ぐため、ウェルの壁面に沿って静かにピペッティングしてください。Triton Xと10%正常ヤギ血清を含むブロッキング液を1XPBSで調製し、添加します。Triton Xの濃度は、必要とされる抗体の浸透深さに応じて最大2%まで使用してください。ホールマウントサンプルをブロッキング液中で1時間、室温でインキュベートします。その後、ブロッキング液を除去します。ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加え、標的抗原に応じて4 °Cで24時間または48時間インキュベートします。Triton X含有1×PBSで速やかに2回すすいだ後、室温で20分間の洗浄を3回行います。次に、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を加え、一次抗体と同じ時間、4 °Cでインキュベートし、一次抗体と同様の方法で洗浄します。続く一連の手順では、ホールマウント標本の残りの部分から側壁のみを切り出し、単一の平面標本にする方法を示します。これにより、高解像度イメージングのための封入が可能になります。免疫染色した脳室部位のホールマウント標本を、1×PBSを満たした清潔な解剖皿に戻し、実体顕微鏡下で後方から前方へと移動させます。スタブナイフを用いて、背側皮質およびその下層にある白質の脳梁を除去し、下脳室帯と線条体の界面を可視化します。次に、ホールマウントの腹側を横方向に長く切開します。微細ピンセットを使用して、組織の背側が上を向くように、この新しい平坦な端で向きを調整します。脳室下帯は均一にピンク色をした薄い帯状の組織であり、一方で線条体には白質の索が浸潤しています。脳室壁を損傷しないよう、ピンセットを2本のピンのように線条体に使用して組織を固定します。前方から開始します。スタブナイフを用いて、線条体と脳室下帯の間を慎重に切り始めます。切り口を脳室表面と平行に保ち、切除組織の厚みを一定に維持することが重要です。脳室下帯が後方に向かって薄くなるため、ホールマウントから脳室壁以外の周囲組織を慎重に取り除きます。ホールマウントは200から300 µmの均一な厚さにする必要があります。ピンセットを使用して、組織片を下から持ち上げ、顕微鏡スライドガラスに転写します。封入剤を滴下し、カバーガラスを掛けます。気泡が入らないように注意してください。サンプルのイメージングを行う前に、カバーガラスを定着させるため、スライドをスライドブックに入れ、4°Cで1〜2日間水平に保管します。以下は、ホールマウント免疫染色およびアペンドフローアッセイの代表的な結果です。最初の画像は、神経芽細胞のマーカーであるdoublecortinのホールマウント染色の低倍率像であり、成体側脳室下帯における遊走中の若いニューロンの連鎖ネットワークを示しています。次は、KI 67を緑色に、血管を赤色に染色したホールマウントの別の低倍率像であり、高倍率像で示される、脳室下帯における分裂細胞と血管系の最近報告された密接な相互作用を説明しています。次の画像は、脳室表面の共焦点画像であり、脳室を裏打ちする細胞の頂端面がβ-カテニン染色（緑色）で、それらの細胞の基底小体がγ-チュブリン（赤色）で標識されています。最後の高倍率画像は、GFAPのホールマウント染色の共焦点スタックから得られた最大投影図であり、脳室表面におけるCSFの流れ、方向、および速度を分析するための、S vz type B1細胞の長いGFAP陽性基底繊維を示しています。アペンド流の動画から連続するフレームを、1枚の合成画像に統合することができます。これらの合成画像では、単一のビーズがアペンドまたは表面を通過する際の、異なる時点での位置を確認できます。以下に、完成した際の結果の例を示します。側脳室の側壁の脳室下帯からホールマウント標本を調製する方法について解説しました。これにより側壁全体のホールマウント視野が得られ、この脳室下帯が連鎖的な遊走のための経路ネットワークとして構成されているという観察結果を含む、長年にわたる多くの発見が可能となりました。また、脳脊髄液がこの壁の上をどのように流れるかを研究することができ、間接的に、これらの細胞がこの非常に広範な経路ネットワークを通じてどのように遊走を誘導しているかを示唆することにも繋がりました。より最近では、この手法により、脳室下帯がピンホイール状に組織化されており、それらのピンホイールの中心に幹細胞が存在することが判明し、この構造内における幹細胞の光学的な終端が明らかになりました。ホールマウントではこの脳室帯を全体的な視点から捉えることができるため、切片では得られない視点を提供します。そのため、他の多くの研究においても有用であると考え、この手法を公開することにしました。ホールマウントの作製において、解剖の精度を向上させるために覚えておくべきいくつかの重要なポイントがあります。1つ目は、適切な照明を確保することです。ホールマウントに影が落ちるように照明を調整してください。これによりコントラストが生まれ、切除すべき箇所が明確になります。2つ目は、ピンセットを2本の可動ピンとして使用することです。ピンセットで組織を強く挟んだり、持ち上げたりしないでください。むしろ、切除を行う際に組織を固定するための2本の可動ピンとして使用します。3つ目は、一般的な牽引と切除を組み合わせて行うことです。解剖時に気づかれるかと思いますが、実際に組織を切除することはほとんどありません。解剖の大部分は、ホールマウントの残部から側壁を取り除く際に行う、2回目の解剖過程での全体的な後退（リトラクション）によって行われます。最も重要な点は、切断面を心室表面の平面と平行に設定することです。これにより、側壁に沿って前方から後方まで均一な厚さを確保できます。また、共焦点高解像度イメージングを行う際に、すべての画像が単一平面でピントが合うようになります。このビデオが皆様の研究に役立つことを願っております。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

神経回路は、地形的に特定の分子プロファイルを持つ機能的なコンパートメントに編成されています。ここでは、多彩なwholemount免疫組織化学的染色のアプローチを使用してグローバル脳の地形を明らかにするための実用的かつ技術的な手順を提供しています。我々はよく理解され細胞構築、小脳の回路を用いる方法の有用性を示しています。...

複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

記録カルシウム活性のためのカルシウムインジケーター色素と脳室下帯（SVZ）細胞をロードする方法について説明する。生後SVZは、神経前駆細胞および神経芽細胞を含む、密に詰まった細胞が含まれています。むしろ風呂ローディングを使用するよりも、我々はより良​​い染料拡散を可能にする組織内部の圧力によって色素を注入した。...

カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製

MRIスキャン(ヒト)、3Dイメージングソフトウェア、免疫組織学的分析を使用して、脳の側脳室の変化を記録します。次に、側脳室の体積変化の縦方向3Dマッピングと、加齢や病気によって人間の脳に発生する脳室周囲細胞の変化の特性評価をマウスでモデル化します。...

ヒトとマウスにおける脳室周囲の組織の側脳室および組織学的特性の3次元モデリング

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。...

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

ここで単位と血液脳関門脳浮遊セクションを使用して高解像度の画像とマウスの三次元再構成のための顕微鏡ベースのプロトコルを紹介します。このメソッドは、可視化、解析、および BBB...

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

このプロトコルの目的は、リッセンセファリックおよびギレンセファリック脊椎動物の中枢神経系の複数の領域から微小血管を分離することです。...

5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

この記事では、豚の水槽マグナに直接カニューレ移植のためのステップバイステップのプロトコルを提示します。<br...

豚のシスターナマグナにおける直接カニューレ移植

このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。...

マウス脳のフリーフローティング免疫染色

極度切除は、深い定量的プロテオーム分析のために、マウス脳内で最大の神経原性ニッチの新鮮な凍結製剤を可能にする。この方法は正確で効率的であり、最小限の組織摂動を引き起こす。そのため、このニッチの分子微小環境や、他の臓器、領域、種の研究に最適です。...

正確で深い定量プロテオーム分析のための成人皮下帯のクライオセクション解剖

神経科学で十分に研究されていない組織である脈絡叢(CP)は、中枢神経系の健康と病気に重要な役割を果たしています。このプロトコルは、CPを単離するためのマイクロダイセクション技術と、その細胞構造の全体像を得るための走査型電子顕微鏡の使用について説明しています。...

マイクロダイセクションとホールマウント走査型電子顕微鏡によるマウス脈絡叢の可視化

ここでは、生きたラットの脳から神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離する方法について、実験的に詳細に紹介します。これにより、健康を損なうことなく、同じ動物からこれらの細胞を複数回収集できます。...

生きたラットからの神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離のための「脳搾乳」法

学ぶ脳室壁のホールマウント技術による神経発生研究。マウス脳を用いて脳脊髄液の流れと上衣細胞の動態を可視化し、成人脳の神経幹細胞挙動を解明する革新的な方法です。

脳室下帯恩顔：Wholemount染色と上衣の流れ

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