2007年4月28日
本方法は、生検および脳スライスのような小さな、困難な管理するために、組織片、の切片再現可能なクライオスタットを可能にします。我々は日常的に400ミクロン厚の脳スライス5〜10ミクロンの連続切片を生成するために組織の取り扱いと標準クライオスタットを容易にするためにシンプルなアルミの凍結の段階を利用する。
こんにちは。私はハーバード大学医学大学院のリサーチフェローであり、韓国の延世大学大学院医学研究科セブランス病院の医学部学生でもあるJun Parkです。ここでは、スライス標本の薄切に使用する材料について説明します。テープとOCTプラットフォームを用いてモールドを準備します。
OCTで包埋し、クライオスタット内で凍結させるか、砕いたドライアイスを使用して、凍結したOCTプラットフォームの周囲からTAFEを取り除いています。凍結チャックとクライオスタットの mounting stage のアライメントマークを確認し、チャックを固定します。OCTプラットフォームを通して切片を作成します。
Ontario表面は平坦です。再表面化したOCTプラットフォームを取り除き、クライオスタットの凍結ステージに設置します。このサンプルをOCTに埋め込みます。なお、このサンプルはあらかじめPBS中の30%グリセロールまたはスクロースで凍結保存されたものです。
これは、外周リングがカラム上端から約5 mm突出するようにして、OCT埋包用のウェルを形成し、凍結カラムを準備する工程です。組織サンプルを凍結カラム表面の中央に慎重に配置し、ウェルがいっぱいになるまでゆっくりとOCTを加えます。その後、凍結カラムを砕いたドライアイスで囲みます。
組織とOCTは20から60秒以内に完全に凍結する必要があります。作製物が温度上昇するにつれ、サンプルが凍結したまま外環を除去できます。このステップで、凍結カラムのサンプルを横にスライドさせ、クライオスタット内に設置します。
OCTプラットフォームの表面にOCTを1滴滴下し、サンプルを配置して圧力をかけます。これにより、サンプルはOCTプラットフォーム上に迅速に凍結固定されます。これは、マークを合わせてサンプルをクライオスタットのマウントステージに固定する工程です。組織サンプルの表面にあるOCT層を切り進めます。
組織の薄切片をガラススライドに封入し、冷凍または室温で保存します。反応は、ガラススライドに固定した組織に対して行うことができます。試薬をスライドに滴下し、緩やかに攪拌します。光に敏感な試薬の場合は、遮光カバーをしてください。反応の以降の段階は、スライドを反転させることで容易に実行できます。スライドを廃棄容器に入れ、スライド上の試薬を拭き取った後、次の試薬を添加します。
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本手法により、生検検体や脳切片など、取り扱いが困難な小さな組織サンプルの再現性の高いクリオスタット切片作成が可能になります。シンプルなアルミニウム製凍結ステージを用いて組織操作を容易にし、標準的なクリオスタットを使用することで、厚さ400 µmの脳切片から5-10 µmの連続切片を作製します。
本手法は、神経科学研究における小型で脆弱な組織サンプルの取り扱いという課題に対し、再現性のある薄切を可能にすることで、後続の免疫組織化学的解析への適用を実現します。電気生理学的に特性解析された脳領域から一貫した組織学的リードアウトを提供することで、ターゲットの検証およびメカニズムのデリスキングを支援します。このアプローチは、限られた組織入力からのデータ品質を向上させることにより、前臨床モデルにおける予測の信頼性を高めます。
この手法は、脳切片標本を用いた機能スクリーニング後の組織学的確認を可能にすることで、ディスカバリー・コンティニュアム(発見の連続体)に統合されます。