Name: マウス肺への溶質の直接気管点眼 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 学ぶマウス肺への直接気管点眼法。気管を露出し、体重に応じた容量の溶液を注入して肺胞に標的投与する技術。呼吸器生理学研究や薬物送達実験に有用な確実なプロトコルを解説します。

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この作品は、NIH K99 HL09222601とMNHに贈られるS＆R財団Ryaji Uneo賞によってサポートされていました。

1。麻酔<ol><li>イソフルランでマウスを麻酔するintraperitaneally麻酔を投与する前に、動物取扱と自制を促進することができる。吸入麻酔薬を使用すると、または特定の研究に適していない場合があります。提案された肺の研究の最初のイソフルランを使用しての衝撃、またはその他の麻酔薬を、決定する。 </li><li>イソフルランで動物を麻酔。ビデオでは、酸素と混合イソフルラン2％で設定されたイソフルラン気化器チャンバーの使用方法を示しています。あなたがイソフルラン室がない場合は、代わりに標準のオープンドロップ露光技術を使用してできます。底部に取り付けられた金網とベルジャー（または他の適切な非多孔質の容器）のラットを囲みます。メッシュワイヤーの下に置かれたガーゼのパッドに、プロピレングリコールのV / Vイソフルラン30％の混合物を適用する。メッシュの使用は、動物が皮膚の炎症や潜在的な過剰投与が発生する可能性があるイソフルランに浸したパッド、に接触しないことが保証されます。イソフルランに短い露光した後、動物は麻酔でなければならず、瓶が傾けているとつま先のピンチの後に応答しないときに立ち直り反射に応答しません。 </li><li>キシラジンとケタミンの混合の腹腔内注射でさらに落ち着いたマウス。 （腸または他の重要臓器の一部が侵入されていないことを保証するために戻って描画する腹腔内注射を行う場合にお勧め）。緩衝生理食塩水（PBS）0.9％滅菌リン酸の8850μLに1000μLケタミン（100 mg / mLの）で150μLのキシラジン（100 mg / mL）を混ぜる。マウスの場合、投与量は体重の10 GMあたり約80μLになります。最終濃度は10 mg / kgキシラジンおよび100 mg / kgのケタミンとなります。動物は、ドライに保ち、体温の過度の損失を防ぐために絶縁する必要があります。眼軟膏は、角膜の乾燥を防ぐために、目に適用することができます。 </li></ol> 2。外科領域の準備<ol><li>外科的切開が行われる領域をシェービングすると、非整形処理区域からの汚染を防ぎます。電気かみそりは密接に動物から毛を剃ることができる。剃毛面積は、切開部位よりも大きくする必要があります。 </li><li>このようなNairさんのような除毛クリーム、のその後のアプリケーションは、残りのすべての毛皮を削除します。外科領域への脱毛クリームの厚い層を適用し、3分間でおきます。湿ったタオルで毛皮や脱毛クリームを拭き取る。 10分を超えるの脱毛クリームを放置しないでください。 </li><li>無菌的外科領域を準備するために、70％アルコール、または別のスクラブのソリューションを使用してください。 </li></ol> 3。外科手術<ol><li>傾斜外科ボード、または角度拘束スタンドに麻酔動物を配置します。 </li><li>首の前面（喉の領域）の近くに小さな切開を加えます。 </li><li>気管リングを視覚化し、アクセスするためには、広頸筋と前方気管筋を離れて分析する。 </li><li>一般的に、気管内注入量は、重量のグラム（約30〜75μL最終容量）あたりの3μlのです。 1mLの皮下（サブQ）30ゲージ、5/16-inch針と注射器を使用してinstillateの適切な量を管理する。シリンジのベベル側のホールドアップと平行気管とし、気管にinstillateのフルボリュームを注入する。 </li><li>動物は、肺への溶質の点眼は、次のあえぎによって応答することができる。シリンジ内に空気を導入し、肺が膨張するかどうかを観察することも成功した挿管の技術を確認させていただきます。 </li><li>気管からシリンジを取り外します。 </li></ol> 4。縫合糸。 <ol><li>ニードルホルダーと針のスエージ（縫合材料が接続されている針の厚い部分を）つかみ。 </li><li>皮膚の厚さに応じて、離れて傷の端から90 °の角度は約1-3 mmの針の先端を皮膚に浸透する。ティッシュ1パススルー後終了針をつかみます。個別に結ばれたシンプルなステッチは、効率的に傷が閉じられます。 </li></ol> 5。動物の回復<ol><li>動物は完全に3から24時間後に麻酔や手術から回復する必要があります。 </li></ol> 6。代表的な結果蛍光化合物の気管内注入、デキストランに結合したCy5.5は、B6マウスの肺における蛍光性化合物（図1）の成功注入を示しています。蛍光色素は、主に肺に対象とするもので、均等に分散されます。すぐにの手順に従って消化管の蛍光シグナルは、食道が誤って手順（図2）中に挿管されたことを示します。捜査官はまた、肺への化合物の標的化送達を確認し、肺を膨張させると、肺の組織切片（2; 3）を調製している手順に従って、instillateの分布を確認することができるまたは固定histologicalサンプル。 <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1蛍光Cy5.5信号が正常に染み込ませ、マウスの肺のX線画像との共同登録。 1.4 mgをCy5.5デキストラン（10μg/μLの濃度で）B6マウスの肺の気管に注入した。 Cy5.5信号は、675 nmの励起フィルターと695 nmの発光フィルターを用いて検出した。 <img src="/files/ftp_upload/1941/1941fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。不完全に染み込ませ、マウスのX線オーバーレイで示される蛍光シグナルの共同登録。腸にCy5.5配信における気管注入プロトコルの結果の間に食道の不適切な挿管。

<ol><li>Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+instillation+as+an+exposure+technique+for+the+evaluation+of+respiratory+tract+toxicity%3A+uses+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations.</a> Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).</li>
<li>Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+epithelial+sodium+channels+examined+in+alveolar+type+1+and+2+cells+patch-clamped+in+lung+slice+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue.</a> J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).</li>
<li>Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activates+amiloride-sensitive+sodium+channels+in+alveolar+type+I+cells+in+lung+slice+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).</li>
<li>Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+extracellular+cysteine%2Fcystine+redox+state+in+bleomycin-induced+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).</li>
<li>Li, T., Folkesson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+alpha-ENaC+inhibits+rat+lung+fluid+absorption+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).</li>
<li>Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+disperse+nanoparticles+for+in+vitro+and+in+vivo+investigation+of+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicol%22%5BJournal%5D)">An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity.</a> Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).</li>
<li>Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+senescence-accelerated+mouse+model+in+bleomycin-induced+lung+injury+suggests+that+bone+marrow-derived+cells+can+alter+the+outcome+of+lung+injury+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).</li>
<li>Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intratracheal+instillation+of+budesonide+using+surfactant+as+a+vehicle+to+prevent+chronic+lung+disease+in+preterm+infants%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study.</a> Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).</li>
</ol>

気管内点滴が試験化合物（6）の毒性を評価するためにいくつかの様々な研究で使用されている、肺胞肺傷害（4、7）を誘導、界面活性剤（8）を置き換えるだけでなく、直接に小さなオリゴヌクレオチドの配信を介して遺伝子発現を変化させる肺（5）。我々は現在、肺への蛍光レドックス感受性材料は薬理学的化合物、DNAベクター、ウイルス、およびで蛍光指示薬を浸透させる）だけでなく、2として、正常及び病態生理学的状態下で生体内で酸化ストレスを測定するために）1を植え付けるの使用を模索している/または肺の流体の輸送上の各instillateの効果を評価するためにマイクロRNA。 吸入暴露（（1）でレビューさ）を介して注入プロトコルを使用して肺に異物を導入するのはいくつかの利点があります。点滴のプロトコルを使用する主な利点は、毒性、発がん性、または放射性化合物への曝露を制限するが含まれています。さらに、固体だけでなく、液体材料は、肺に導入することができる。間違いなく、気管注入のアプローチを使用しての最大の欠点は、instillateの導入は、侵襲的および非生理的であるということです。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td>Webster Veterinary</td><td>14043-220-05</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Lloyd, Inc.</td><td></td><td>新動物用医薬品申請 #139-236</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-001-10</td><td></td></tr><tr><td> Nair</td><td></td><td></td><td>ドラッグストアで購入可能</td></tr><tr><td>1mL 皮下注射用シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td>26 5/8 G</td></tr><tr><td>4-0 ナイロン縫合糸</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1894G.S30</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス肺への溶質の直接気管点眼

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

気管内点滴は直接肺に溶質を提供します。この手順では、肺の遠位領域にinstillateの配信をターゲットとし、従って多くの場合、肺胞の勉強を目的とした研究に組み込まれています。我々は、マウスで気管内点滴を行うための詳細な生存のプロトコルを提供しています。このアプローチを使用して、一つは遠位肺に（例えば、肺の治療薬、界面活性剤、ウイルス、および小規模なオリゴヌクレオチドとして）テストの溶質または固体の配信をターゲットにすることができます。気管点滴は、主に上気道を対象に、おそらく潜在的に有害物質への捜査官を公開することができる吸入プロトコルを介して、好みの方法論があります。さらに、気管注入プロトコルを使用して、動物は完全に非侵襲的な手順から回復することができます。これは、同じ動物を用いた試験の動物、または再インストール時にも、その後の生理的な測定をすることが可能になる。肺に導入instillateの量は、慎重に決定され、動物の回復を確実にするために浸透圧バランスする必要があります。通常は、30から75μLinstillateのボリュームは、マウスの肺に導入することができる。

気管内点滴は直接肺に溶質を提供します。この手順では、肺の遠位領域にinstillateの配信をターゲットとし、従って多くの場合、肺胞の勉強を目的とした研究に組み込まれています。我々は、マウスで気管内点滴を行うための詳細な生存のプロトコルを提供しています。

気管内注入により、溶質を肺に直接届けることができる。この処置は、注入物を肺の末梢領域へと届けることを目的としている。

本手順では、溶質を肺に直接注入することができます。まず気管を露出させます。小型齧歯類の被毛を除去し、頸部の前方に小さな切開を加えます。気管を露出させます。1 mLの皮下注射針を用い、体重1 gあたり3 µLの溶液を気管から注入します。シリンジを抜き、創部を縫合します。こんにちは。エモリー大学生理学部のMa Helmsです。こんにちは。エモリー大学医学部のMauricio Rojasです。本日は、肺の遠位部に溶質を直接注入する手順をご紹介します。当研究室では、注入したさまざまな化合物に対する肺液クリアランスを研究するために、日常的にこの手順を用いています。また、当研究室では、肺損傷マウスモデルを作製してbliを投与するためにこの手法を利用しています。小型げっ歯類の肺への溶質の直接注入は、皆様の研究に有用であると考えられます。それでは、始めていきましょう。手術の準備として、マウスをまずイソフルランで麻酔し、次いでキシラジンとケタミンの混合液を腹腔内投与してさらに鎮静させます。足指をピンチして、動物が完全に麻酔状態にあることを確認してください。次に、電気シェーバーを使用して手術部位の被毛を剃ります。残った毛を除去するため、手術部位に除毛クリームを厚く塗布します。除毛クリームを3分間放置した後、湿ったタオルで被毛とクリームを拭き取ります。手術部位を70%アルコールで拭き、続いてベタジン手術用スクラブで洗浄します。これにより、動物の無菌的な準備を整えます。これで動物の手術準備が完了しました。気管内投与の手順を開始するために、麻酔した動物を傾斜した手術台の上に配置します。頸部または喉の前面付近に小さな切開を加えます。鉗子を使用して広頸筋を押し広げ、その後、気管前筋を切開します。これにより、気管輪を視覚的に確認し、アクセスできるようになります。気管を露出させた後、1 mLの皮下注射用針とシリンジを用いて、適切な量の注入液を投与します。シリンジの針先（ベベル）を上に向け、気管と平行に保持し、注入液の全量を気管内に注入してください。一般的な気管内投与量は、体重1gあたり3µLです。気管からシリンジを抜きます。肺に溶液が注入されると、動物が喘ぐような反応を示すことがあります。シリンジを通して空気を注入し、肺が膨張するかどうかを観察することでも、挿管が成功したことを確認できます。4-0ナイロン縫合糸で切開部を閉鎖します。針持で、縫合糸が装着されている針の最も太い部分（針尻）を把握し、傷口の縁から約1〜3mm離れた位置で、針先を皮膚に対して90度の角度で刺入します。皮膚の厚さに応じて、組織を1回通過させた後、出ている針を掴みます。個別に結紮した単純縫合により、効率的に創傷を閉鎖できます。ここでは、気管内投与の代表的な結果をいくつか示します。最初の画像は、B6マウスの肺にデキストリン結合蛍光化合物Sci-Fi 0.5を正常に投与した様子を示しています。SCI 5.5シグナルとX線画像を共登録することで、蛍光染料が主に肺に標的化されており、注入直後に均一に分布していることが確認できます。対照的に、この2枚目の画像は、不適切に注入されたマウスの結果を示しています。処置直後に胃腸管に蛍光シグナルが認められることは、処置中に誤って食道に挿管されたことを示しています。以上で、肺の遠位部に溶質を直接注入する方法をご説明しました。この操作やその他の処置を行う際は、研究における動物利用に関する所属機関のガイドラインに従うことが重要です。これで終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

このビデオでは、肺の点滴、固定、肺活量測定のために気管に液体を導入する簡単で信頼性の高い方法を説明しています。...

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