フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

フローラルディッピングは、シロイヌナズナ植物をレポーターコンストラクトで形質転換するために使用されます。次いで、得られたトランスジェニック植物は、レポーター遺伝子の発現について調べられる。最初に若い開花シロイヌナズナ植物をアグロバクテリウムの溶液に浸し、レポーターコンストラクトを含むエフェシアンに投与します。

次に、植物は通常の成長状態に戻り、種子が生成され、その一部が外来遺伝子で形質転換されます。手順の3番目のステップは、植物から種子を収集し、抗生物質を含む選択培地に播種することです。最後に、抗生物質を含む選択培地で成長する苗木が検査されます。

外来遺伝子を含むトランスジェニック苗は抗生物質に耐性があり、生き続けますが、非トランスジェニック苗は最終的に白くなり死にます。トランスジェニック実生のレポーター遺伝子発現は、トランスジェニック実生をレポーター遺伝子の基質で染色し、解剖顕微鏡で細胞や組織を観察することにより観察します。こんにちは、メリーランド大学細胞生物学・分子遺伝学部のDr.Zou研究室のChloe Maraです。

私もDr.Z Chileの研究室のWna gvaです。今日は、シロイヌナズナ植物を形質転換するための花の深さの方法を紹介します。次に、トランスジェニック植物で報告された遺伝子発現を調べる方法を示します。

私たちの研究室では、これらの手順を日常的に使用して、遺伝子発現と機能している植物を研究しています。それでは始めましょう。この手順は、変換の約 1 か月前に開始します。

ウサギのウサギの種を、ポットあたり約10〜15の植物を持つ4〜8つの5インチ四方のポットに播種し、次にソードシードを4度の種子に3日間冷蔵室に置いてから、それらを置きます。繁殖力が低下した突然変異シロイヌナズナ植物を形質転換するための植物成長チャンバー。ポットの数を増やして、ポットを6〜10個追加します。

標準的な条件下で植物を育てます。より短い日またはより低い温度のレジメンで育てられた植物は、開花するまでに時間がかかり、形質転換の準備が整うまでに時間がかかります。適切な植物の手入れは、形質転換を成功させるために不可欠な健康な植物を保証します。

植物がボルトで固定されて開花し始めたばかりのときに、成長している植物に農薬を散布することをお勧めします。彼らは、変革の効率を高めるための変革の準備ができています。変換の3〜4日前に、ボルトで固定されたらすぐに蛍光シュートでメインを切り取ります。

形質転換の2日前に、50マイクログラム/ミルを含む40ミリリットルのLBを接種します。カニンとアグロバクテリウムテマFasion株GV 3 1 0 1は、PTsああ、2つのガスコンストラクトを含み、摂氏20〜30度で振とうインキュベーターで一晩成長します。ガスはPIN 20ベクターにクローン化され、これもまた缶マイシン耐性を持っています。

TSO 2プロモーターは、形質転換の前日である翌日にGusの細胞周期制御発現を促進します。8ミリリットルの一晩培養物を、50マイクログラム/ミリリットルを含む400ミリリットルのLBに移します。CINは、同じ日に摂氏28〜30度の不安定なインキュベーターで一晩成長します。

また、植物に水をやります。これにより、土壌が吸収しすぎないようにします。形質転換の日のフローラルディッピング中の浸潤媒体は、600ナノメートルで細菌の吸光度に続きました。

アグロバクテリウム培養のOD600が約0.8に達したら、アグロバクテリウム培養物を一晩で8分間スピンダウンします。摂氏4度で5, 000 RPMで再懸濁液、新たに作られた浸潤媒体の1リットルのアグロバクテリウムペレット。培地はオートクレーブである必要はありません。

浸透培地を含む1リットルのアグロバクテリウムを8インチ×15インチ×2インチのpyxガラス皿に注ぎます。そこで、植物を浸透液に浸しようとしています。これをやっている間。

ポットの土を浸透液に浸さないように特に注意してください。バクテリアの準備ができたので、ポットを反転させ、植物のすべての地上部分を浸透ろ過液に浸します。5分間保持します。

一度に1つのポットを浸し、プラントのすべての地上部を浸透媒体に浸します。土壌に浸透媒体を吸収させないようにして、後で土壌に真菌が成長する可能性を減らします。浸した後、すべての浸したポットをトレイのペーパータオルの数層の上に横向きに置きます。

ペーパータオルは、余分な量の浸透媒体を吸収します。トレイをラップで覆い、湿度を確保します。翌日、トレイを植物成長チャンバーに入れます。

ペーパータオルのラップをはがし、鍋を立てて置きます。その後、さらに4〜5日間、これらの植物に水をやらないでください。約3週間後に種子をセットし、種子を大量に収集するまで、植物を通常どおりに維持します。

トランスジェニックシードの選択に進みます。まず、ミリリットルあたり50マイクログラムのMs.Mediumが入ったプレートをセットします。その後、マイシンは種子の量を計量して推定できます。

0.1 グラムの種子が約 5 、 000 個の種子に等しいことを知って、抗生物質耐性トランスジェニック植物を選択するには、最低 20 、 000 個の種子をスクリーニングする必要があります。次に、15ミリリットルのファルコンチューブで70%エタノールで30秒間種子を洗浄して、種子を滅菌します。次に、種子を滅菌水で洗います。

店で購入した5%漂白剤を1〜10希釈した溶液に種子を30秒間浸します。そして最後に、種子を滅菌水で3〜6回すすぎます。種子を滅菌した後、滅菌フードで作業し、各MSプレートに約5, 000個の種子をピペットで移します。

ミリリットルあたり50ミリグラムが含まれています。マイシンは、プレート上に種子を均等に広げ、汚染を避けるためにプレートを微細孔3Mテープで密封することができます。プレートを4°Cで暗所で3〜4日間インキュベートし、プレートを植物成長チャンバーに移します。

約14日後、トランスジェニック苗は緑色のままです。それらは、淡い緑色の停止成長に変わり、最終的には死に至る非遺伝子組換えの苗木と比較して、cosに加えてより大きく、本物の葉を発達させます。形質転換効率は平均で約0.1〜0.2%である必要があります。

野生型植物の4つの鉢を形質転換することにより、約100のトランスジェニック系統を得ることができます。トランスジェニック植物を特定し、その根をゆっくりと培地から引き抜きます。個々の苗を土に移し、プラスチックで1〜2日間覆います。

次に、カバーを取り外します。トランスジェニック苗を収穫した後、植物が成長するのを待ちます。それらをガラスシンチレーションバイアルまたはcold.90%アセトンを含むeinorチューブに入れます。

サンプルを氷、ポリスチレン、ポリプロピレンではなく保管します。マイクロタイタープレートは、多数のサンプルの分析にも使用できます。すべてのサンプルが回収されたら、バイアルを室温で20分間置きます。

この間に、xglなしで新しい染色バッファーを作り、氷の上に置きます。また、100ミリモルのxgl原液を最終濃度の2ミリモルxclに希釈することにより、xglを含む染色緩衝液を調製します。20分間のインキュベーションの終わりに、サンプルからアセトンを除去し、xglを含まない染色バッファーを添加します。

次に、xglを含まない染色バッファーをサンプルから取り出し、xglを含む染色バッファーをサンプルに加えます。真空下で15〜20分間サンプルを浸潤します。真空をゆっくりと解除し、すべてのサンプルが染色液の表面の下に沈むことを確認します。

必要に応じて、すべてのサンプルが表面下に沈むまで浸潤を繰り返します。真空が解放された後、真空浸透後、xglを含む染色バッファーでサンプルを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、インキュベーターからサンプルを取り出し、染色バッファーを取り出します。

連続したエタノールシリーズでサンプルを室温で30分間、交換ごとに洗浄します。最後に、組織をFAA固定液に室温で30分間固定します。次に、FAA固定液を取り外し、70%エタノールを追加します。

デジタルカメラを搭載した解剖顕微鏡で組織を検査するか、ここに示されている植物で後で見るために摂氏4度で保存します。ダークブルーは、TS O2プロモーターによって駆動されるGUS活性を反映しています。シュートの頂点には、活発に分裂する細胞を持つ原始的な若い葉があります。

これは、DNDP生合成のために高発現したTS O2遺伝子に反映されており、ガス活性の濃い青色で示されています。青色に染まった側根原始も観察でき、根の先端にも染色が見られます。不均一な散発パターンは、細胞周期の位相特異的発現の特徴です。

フローラルディップ法を使用してシロイヌナズナ植物を形質転換し、トランスジェニック苗のレポーターガス発現を調べる方法を紹介しました。この手順を行うときは、健康な植物を飼うことが重要です。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。