オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

次の実験の全体的な目標は、胚性幹細胞から30日間にわたる一連の培養ステップを通じてオリゴデンドロサイト前駆体を生成することです。これは、まずマウスES細胞から胚体を生成して細胞分化を開始することで達成されます。第2のステップとして、胚体は低分子であるレチノイン酸と純粋なモルヒネで処理され、細胞のリーガデンへの指向性分化を誘導します。

サイト前駆体。第3のステップとして、胚体はさらに22日後に単一の細胞に分解されます。培養では、細胞の約80%がOPCです。

次に、MESC由来のOPCをNAV 1.2サブユニットを保有するバオウイルスに形質導入し、スパイキングOPCを生成するために、免疫蛍光顕微鏡法および電気生理学的記録に基づいて、これらのMESC由来OBCのOPCマーカーの発現およびスパイキング特性を示す結果が得られる。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校の細胞生物学・人体解剖学部のIng博士研究室のPong Chiangです。また、北カリフォルニアのシュライナーズ小児病院とも提携しています。

こんにちは、私はバイアル・ラージで、同じくデン研究所の出身です。今日は、マウスエムロン幹細胞をジェノサイド前駆細胞に分化させる手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて、胚性幹細胞derdオリゴデンドロサイト前駆体の性質を研究し、より優れた治療能力を持つ細胞を作製しています。

それでは始めましょう。今日、オリゴデンドロサイト前駆細胞またはOPCは、OG 2 GFPマウス胚性幹細胞株から生成されます。これらの胚性幹細胞は、最適な密度で健康を維持し、自然分化を防ぐために、3日ごとに継代する必要があります。通路。

層流フードの下で70%の合流点にあるときのESS細胞。培養物の上の培地を取り除きます。PBSとトリプシンの目で2ミリリットルの予熱剤ですすいでください。

摂氏37度で5分間のLEエクスプレスを1回旅行します。反応を停止し、細胞を4ミリリットルのMES細胞培地に再懸濁します。細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、1000RPで5分間ペレット化します。

MES培地中の照射済みメスフィーダーのコンフルエント層上の細胞の10分の1をMESL培地プレートに再懸濁します。3日後、ES細胞は約70%コンフルエントであり、継代または懸濁して胚体を形成し、胚体を誘導し、分化を開始する準備ができています。トリプシンマウスES細胞コロニーは以前と同様に、次いでノックアウト血清置換またはKSR培地で細胞を再懸濁します。ヘモTER上の細胞をカウントし、懸濁液をKSRで希釈します。

中程度から15, 000細胞/ミリリットルのプレートは、超低アタッチメント6ウェルプレート培養の各ウェルに3ミリリットル。細胞を摂氏37度で4日間懸濁させました。2日ごとにメディアを完全に交換してください。

4日目から、4日目に毎日培地を交換します5日目にKSRに0.2マイクロモルのレチノイン酸を補給し、6日目と7日目にレチノイン酸と1マイクロモルの原始飢饉の両方を補充します。0.2マイクロモルのレチノイン酸と1マイクロモルの原始飢饉を補給した2つの培地内で胚体を養います。培養で8日後、胚体の大部分はGFPを発現し、トリプシンの目を分解して以前と同様に細胞をカウントする準備ができています。

その後、10ミリリットルあたり5番目の細胞の3.5倍でそれらを懸濁します。OPCミディアムでは、OPCミディアムで懸濁液の3ミリリットルをリフレートします。ポリオルニチンコーティングされた60ミリメートルの皿を約毎週使用すると、細胞はコンフルエントになり、3分間のトリプシン化で以前と同様に細胞にこの通路のようになります。

最初の蘇生停止から30日後。KSR培地では、細胞はオリゴデンドロサイト前駆細胞の特性を示し、スパイキングOPCを生成します。マウスESL由来のOPCは、50〜70%のコンフルエントです。

培地を1つのXPBSと交換して、細胞をすすぎます。電圧依存性ナトリウムを導入する。チャネル 1.2 アルファ サブユニット。

背面のMAMナトリウムチャネルキットを使用しています。1ミリリットルのバックMAM成分Aと4ミリリットルのXPBSを混合します。PBSリンスを取り出し、希釈した成分を加えます。

摂氏37度で2時間インキュベートします。バックメモリエージェントを、キットの説明に従ってコンポーネントBおよびCで強化されたOPCメディアと交換します。指示は、摂氏37度でさらに2時間インキュベートします。

インキュベーション後、強化培地を新しいOPC培地と交換します。さらに24時間の培養後、ESL由来のOPCのこの時点でのスパイクをアッセイできます。EBSはGFP蛍光を示していません。

EBSは強いGFP発現を示し、元の蘇生懸濁後約30日間は脱凝集培養の準備ができています。KSR培地では、大部分の細胞がNG 2染色に対して免疫陽性であり、これはGFP発現と一致しています。しかし、脳のOPCとは異なり、これらのMES細胞由来のOPCは、細胞が0ミリボルトに脱分極した場合でも活動電位を発火させることができません。

ウイルス形質導入によりNAV 1.2サブユニットを導入した後、これらのMES細胞由来OPCは興奮し、発火活動電位を発現します。マウス胚性幹細胞をOPCに分化させ、ウイルス形質導入によってスパイキングOPCを生成する方法を示しました。この手順を行うときは、モルヒネとFGF 2ごとにレチノイド酸を適切に保存し、常に新鮮なアリコートを使用し、使用後に余分なtレチノイド酸を廃棄することを覚えておくことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。