分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激
2011年3月2日
デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）は、神経細胞の興奮性を制御するために、時間と空間の複雑なパターンを生成することができます。 DMDシステムの設計、建設、および操作に関連する問題について説明します。このようなシステムは、遠位樹状分岐点を越え非線形統合のデモンストレーションを有効にする。
この手順の全体的な目標は、時間と空間の複雑な光のパターンを制御して、ニューロンを刺激するために使用できるようにすることです。これは、まず、顕微鏡の光路上の適切な共役像面にDMDチップを配置することによって達成されます。手順の2番目のステップは、レーザーなどの強力な光源でDMDを適切に照らすことです。
手順の 3 番目のステップは、コヒーレント照明の斑点効果を排除することです。手順の最後のステップは、DMDチップを操作するためのグラフィックユーザーインターフェイスを統合することです。最終的には、DMDシステムを用いたケージ神経伝達物質のマルチサイト溶解により、これまで困難であった実験が比較的容易に完了するようになったことを示す結果を得ることができます。
こんにちは、私はマイケル・モハメッドで、メリーランド大学神経学部のチャマン・タン博士の研究室にいます。今日は、光学顕微鏡で複雑な除去パターンを生成する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して樹状突起統合を研究しています。
それでは始めましょう。このプロトコルでは、実験的な神経科学のためのデジタルマイクロミラーデバイスまたはDMD照明システムの操作を実証します。DMDは、数十万の微細な可動ミラーを長方形の配列に配置した光半導体チップであり、その表面では、各ミラーの位置は画像のピクセルに対応します。
各ミラーは、2つの方向の間で傾くように個別に制御できます。オフ方向では、光は試料照明の光軸から遠ざかります。オン方向では、光は光軸に沿って向けられます。
DMDは、非常に強い紫外線に耐え、オンピクセルとオフピクセルの間に高いコントラスト比を生成し、数十マイクロ秒で2つの状態を切り替えることができるため、溶解に適しています。生物医学研究のためのDMDの応用は、画像操作ソフトウェアとハードウェアの広範な使用、および画像表示分野での商業的関心によって支援されています。モジュール式コンポーネントは、テキサス・インスツルメンツ社が DLP ディスカバリ・キットとして販売しており、DMD をマイクロ・システムに適合させるためのサポート電子ドライバーを提供します。
顕微鏡の光学に関する基本的な概念を理解する必要があります。基本的な現代の蛍光顕微鏡は、イメージングパスと照明パスで構成されています。対物レンズ、フィルターキューブ、およびイメージングと照明経路用の2つの異なるチューブレンズで構成されています。
顕微鏡は、試料の像面に共役する位置を持つように設計されており、試料面に焦点が合っている物体は、これらの共役像面にも焦点が合っているように見えます。この概念の帰結として、共役像面で作成された明るい像は、標本像面にも鮮明に投影されます。この戦略は、コンピューターで生成された照明パターンを試料に投影するために使用されます。
レーザービームは、共役像面に配置されたDMDチップ上のマイクロミラーによって実装されたパターンを照らす非常に明るい光源として機能します。A DMD照明システムの設計は、可視波長の光を利用するオプトジェネティクス実験に使用される励起光に依存します。照らされたパターンは、カメラパスを介して持ち込むことができます。
したがって、DMDチップは、デュアルカメラポートモジュールの2つのカメラポートのうちの1つに簡単に取り付けることができます。逆に、ケージコンパウンドの溶解など、UV領域の光を使用する実験では、光を落射照明パスに通し、よりアクセスしやすい共役像面を作成する必要があります。これは、イメージングチューブレンズがUV透過用に設計されていないためです。
代わりに、照明チューブレンズはUV透過に使用され、画像形成に適切な役割を果たします。DMD上の各マイクロミラーは、チップの平面に対して正と負の12度の傾きを切り替えることができます。コンピューターから受け取るデジタル入力に応じて、回転軸は各ミラーの対角線上の角に沿って、チップの長方形の側面に対して45度になります。
ミラーチルトの向きは、チップの前面の1つの角にある金色の三角形で示されます。マイクロミラーの傾きは、入射する照明ビームのピッチと方位角の位置合わせを決定します。DMDを照らすには、まず、照明ビームのピッチをDMDチップの垂直軸から24度に設定し、方位角をミラー回転軸に垂直にするように構成します。
正確なビームアライメントは、効率的な運用のために重要です。溶解実験用。レーザー光源を使用して、迅速なアンケージングに必要な高強度の集束可能なビームを生成します。
ここでは、準連続ダイオード励起固体周波数3倍のNDアテレーザーが採用されていますが、レーザー出力のごく一部しか実際に試料に供給されないため、比較的高出力のレーザーを使用します。DMDシステムを使用する場合は、レーザーの出力をマルチモードファイバーに送り出すと、DMDを照らすための正しい軸に沿ってレーザーを簡単に配置および向き付けてスペックルの解決策を提供できます。コヒーレント照明から発生する問題は、光を光ファイバーを介して透過します。
この繊維は、パゾ電気繊維ストレッチャーに巻き付けられ、約40キロヘルツで振動するように駆動されます。ファイバーの微視的な伸縮は、各光刺激パルスのミリ秒の持続時間中にスペックルパターンを何度も移動させるのに十分であり、したがって、スペックリングを効果的に排除します。最後に、光ファイバの出力をUV顕微鏡対物レンズと照合してDMDを照らし、CCDピクセルをDMD画像ソフトウェアと共登録し、個々のDMDミラーをイメージングCCDカメラの特定のピクセルに相関させることを書き込みました。
ソフトウェア内のグラフィカルユーザーインターフェースにより、ユーザーはグラフィカルユーザーインターフェースを使用して、CCDイメージ上の領域に対応するDMDミラーの向きをコンピューターマウスで割り当てることができます。コンピュータ画面に表示されている画像の上にカーソルを移動して光刺激の位置にタグを付け、タグ付けされた関心領域をクリックして、光の送達パターンストアをプログラムします。コンピュータ画面上に一連の別々の画像としてマークされたパターンは、各空間パターンのレーザーパルスのタイミングをソフトウェアにプログラムします。
これは、データ収集プログラムP clampと統合されます。最後に、データ集録プログラムを使用して、DMD電子機器のタイミング、レーザーのゲーティング、およびターゲットニューロンからのパッチクランプ電気信号の集録を調整します。ここでは、光学系の分解能のキャリブレーションを示します。
最小スポットサイズは、蛍光ターゲットから測定した値を示しています。有効な生理学的分解能は、光刺激の関数としての電流の流れの振幅によって測定されます。このスポット位置は、直径2マイクロメートルの樹枝状枝に隣接して撮影されたグルタミン酸檻に入れたものである。
スポットが移動されたとき。異なる強度の光刺激に対する電気的応答を直交して示しています。溶解強度の関数としての電圧クランプ応答が示されています。
分布樹状突起刺激は、DMDベースのシステムを使用して簡単に実装できます。ここでは、2つの樹状突起枝に円でマークされた写真刺激のスポットの数を増やすことによって、入力強度を変化させました。空間的な合計は、分岐点間で非線形にすることができます。
これは、分岐への 2 つのドアに到達する入力振幅の増加とともに、ますます超線形になります。これらの結果は、樹枝状分岐点間の非線形な合計方法を明確に示しています。超直線性は、主にNMDA受容体によって媒介され、電位依存性チャネルによって媒介されません。
これは、2つのNMDAアンタゴニストA PVおよびMK 8 0 1の適用により、非線形挙動が大幅に排除されることから実証できます。ここまで、神経組織のパターン光刺激のためのDMDベースのシステムの基本設計と操作方法を紹介しました。このシステムは、光遺伝学的実験に使用されるような可視光による刺激に適応させることができます。
また、単一光子溶解に使用されるように、UVライトに近い光に適応することもできます。この手順を実行する際には、波長が400ナノメートル未満の光を使用し、ほとんどの人が落射照明経路を通過する場合、照明ビームを数度以内で正確に位置合わせすることが重要であり、コヒーレント光を使用する場合は、斑点を効果的に除去する必要があることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、神経刺激用の複雑な光パターンを生成するためのデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）の使用について説明します。この手順により神経興奮性の制御が可能となり、遠位樹状突起分岐点での非線形統合を実証します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- オプトジェネティクス
- 神経刺激
背景
- デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）は光パターンを操作できます。
- 神経興奮性の制御は神経科学研究にとって重要です。
- 神経刺激の従来の方法には限界がありました。
- DMDシステムは複雑な実験デザインを容易にします。
研究の目的
- ニューロン刺激のための時間と空間における光パターンを制御すること。
- 神経科学におけるDMDシステムの有効性を実証すること。
- 以前は実施が困難だった実験を可能にすること。
使用した方法
- 顕微鏡の共役画像面にDMDチップを配置すること。
- レーザーなどの強力な光源でDMDを照明すること。
- 干渉照明の斑点効果を排除すること。
- DMD操作用のグラフィックユーザーインターフェースを統合すること。
主要な結果
- 神経刺激のための複雑な光パターンの制御に成功。
- 樹状突起分岐点での非線形統合の実証。
- ケージ神経伝達物質の多重部位溶解の促進。
- 複雑な実験の実施が容易になったことを示す結果。
結論
- DMDシステムは神経興奮性を制御するための効果的なツールです。
- 神経科学における新しい実験の可能性を可能にします。
- 将来の研究は、この技術を高度な研究に活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Patterned photostimulation using digital micromirror devices (DMD) enables precise spatiotemporal control of neuronal activity, addressing a key challenge in neuroscience for studying complex dendritic integration. This approach supports target validation by allowing researchers to interrogate how distributed synaptic inputs are processed across dendritic branches, a critical factor in understanding neuronal computation and disease mechanisms. The ability to eliminate speckling and integrate with electrophysiology enhances reproducibility and quantitative rigor, which are essential for de-risking mechanistic hypotheses in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic integration mechanisms across branch points, supporting hypothesis testing for synaptic function and plasticity targets.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for multi-site uncaging experiments, reducing variability in assessing neuronal responses to patterned stimuli.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates standardized light pattern delivery for quantifying neuronal excitation, enabling assay development for compounds affecting dendritic signaling.
- Operational Value: Supports high-contrast, rapid-switching stimulation compatible with automated imaging and electrophysiology readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links NMDA receptor-mediated supralinear integration to disease-relevant pathways, offering a mechanistic readout for neurotherapeutic screening.
- Operational Value: Adaptable to visible light for optogenetics, allowing translation from acute slice studies to chronic in vivo models.
Pipeline & Workflow Integration
The DMD photostimulation system fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, particularly for neuroscience targets involving synaptic signaling and dendritic computation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing how spatial input patterns influence postsynaptic responses, informing target engagement strategies.
- Screening: Enables quantitative, patterned stimulation as a functional readout for compound effects on dendritic integration.
- Analytics: Generates measurable electrophysiological outputs (e.g., current amplitude, voltage response) that correlate with stimulation intensity and pattern.
- Translational Research: Connects NMDA-dependent nonlinearity to pathophysiological processes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Enterprise Reuse: The core DMD illumination strategy can be reused across multiple neuroscience projects requiring patterned photostimulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal mechanism models through controlled, repeatable dendritic stimulation paradigms.
- Operational Value: Standardized light delivery and speckle reduction improve inter-experiment consistency and cross-team collaboration.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by clarifying nonlinear integration properties early in discovery.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by providing mechanistic insight into how therapeutic compounds may affect dendritic signal processing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, particularly for UV wavelengths where precise beam pitch and azimuth are critical.
- Depends on high-intensity laser sources and multi-mode fiber delivery with piezoelectric stretching to mitigate speckle from coherent illumination.
- Necessitates integration with electrophysiology systems (e.g., patch clamp) and software for synchronizing DMD patterning, laser gating, and data acquisition.
- Adaptation to visible light for optogenetics simplifies UV-specific constraints but retains need for conjugate plane alignment and GUI-based pattern control.
- Practical limitations include the need for conjugate image plane accessibility, which may require optical path modifications on upright microscopes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Introduction
1:19
Introduction to DMD Chips and General Design Considerations
4:12
Illumination of the DMD
6:14
Operation of the System
7:16
Representative Results Demonstrating Patterned Photostimulation with DMDs to Investigate Dendritic Integration across Branch Points
8:43
Conclusion
