Name: 分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶデジタルマイクロミラーデバイスを用いた複雑な光パターン制御による神経細胞刺激法。樹状突起分岐点間での非線形統合を示し、従来困難だった多部位ケージ神経伝達物質解離実験を容易に実現する革新的な神経科学研究手法です。

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一般的な設計上の考慮事項写真刺激の波長は、そのようなoptogenetic実験用として、可視範囲内にある場合、システムのレイアウトは、UV光分解実験よりもかなり単純になります。一つは、顕微鏡の会社のすべてから使用可能なデュアルカメラポートのモジュールを購入する必要があります。 DMD平面は2つのカメラポートのいずれかの共役結像面に配置することができます。カメラにつながるの撮像管のレンズは市販の顕微鏡のいずれかでUV波長に対して補正されていないので、しかし、UV光分解でDMDから発信された光は、落射照明のパス（図3A）を介して持ち込まれている必要があります。 350nmでの撮像管レンズの球面収差は、狭い場所に光を集中すると十分な空間分解能を生成する能力を防ぐのに十分厳しいです。平行レーザービームが同じ光軸に沿って持って来られるときにチューブレンズが削除されるため、この問題は、共焦点顕微鏡では発生しません。そこにチューブのレンズはすべて部分的に紫外波長における球面収差を補正しているため、UV照射の問題は、落射蛍光パスを通る光を取り込むことで解決できます。我々は、どの程度ジャーナルの希望に顕微鏡の光学系に拡張することができます。科学界は、このトピックでは一般的な迅速な興味がでており、よくそれを教える多くのソースがないです。 顕微鏡の改造を最小限とするため落射蛍光ユニットでタイトなスペースの制約のためには、DMDは、リレーレンズ（との関係でDMDユニットの位置を指摘することによって作成された、新しく作成された共役結像面に配置されています顕微鏡）。商業UVは、リレーレンズを修正（図にして顕微鏡でそれを指摘）（特殊光学）購入した。 DMDのイルミネーションそのバイナリの入力を受け取るとマイクロミラーは、正と負の12 °傾斜チップの面に対して相対的に切り替えることができます。回転の軸は、各ミラー（チップの両側に45 °）の対角に沿っている。ミラーの回転の向きは、チップの表面上の1コーナーで金色の三角形で示されている。マイクロミラーの傾斜角度は、着信照明ビームのピッチとazithmusの配置を指示します。照射ビームのピッチは、DMDチップとミラーの回転軸に垂直になるようazithmusのニーズの垂直な軸より24 °である必要があります。正確なビームアライメントには、効率的な運用のための非常に重要です。プロトタイプシステムでは、私たちは設計と加工の不備を補正するために許容される複数の手動のチルト調整を設計した。これはかなりかさばる必要以上なシステムとなりました。光にもたらすための代替、よりコンパクトな配置が（有用と判断した場合、代替設計を示す）ことが可能です。 光分解の実験のためのレーザ光源は、迅速なアンケージングために必要なビームの焦点高い光強度を生成するために必要です。高輝度焦点を絞った光を必要としないoptogenetic実験のために、非コヒーレント光源は十分です。光分解の実験はここで説明では、準連続ダイオードは、周波数がNdVO4レーザー（1 W、355 nm）を倍固体（DPSS）を励起採用。 （光分解用光源の選択肢の詳細については文献2参照）。 DMDシステムを使用するときにレーザーの出力のごく一部が実際に試料に配信されているため、比較的高出力のレーザーは、ここで説明する実験に必要となります。試料に供給される光の量は、レーザビームによって照射された領域内でON / OFFのミラーの数の比に比例します。 レーザ光源が必要な場合は、DMDを照明するための適切な軸に沿って容易に位置し、配向させることができるように、それはマルチモードファイバへのレーザーの出力を起動するのが最善です。光ファイバを通して光を透過することはコヒーレント照明に固有のスペックルパターンを除去する方法、2番目の問題を解決します。繊維は〜40kHzで振動する圧電ファイバストレッチャ（モデル915、カナダの機器＆リサーチ株式会社）に巻き取られる。 （リグのポイントこれらを）繊維のストレッチ顕微鏡は、このように効果的に斑点の影響を排除し、各写真の刺激パルスのミリ秒の持続時間の間にパターンを何度もスペックルの動きに十分です。光ファイバの出力は、UV顕微鏡対物（オリンパスDApo20UV）でコリメートされる。 （これを指す）システムの光学解像度のキャリブレーションは、図に示されています。 3B。として、写真のスポットの位置の関数として電流の流れの振幅で測定された効果的な生理的分解能刺激は、図に示されています。 3C。異なる強度の光刺激に対する電流応答を図に示します。 3D。 システムの操作： DMDのミラーとの共同登録するCCDの画素社内のソフトウェアは、イメージングCCDのカメラの特定のピクセルに個々のDMDのミラーの対応を決定する書かれています。このソフトウェア内のグラフィックユーザインタフェース（GUI）は、ユーザーがマウスでタグ付けされたCCD画像上の領域に対応するDMDのミラーを割り当てることができます。このように、写真の刺激のための場所は、単にコンピュータの画面上に表示された画像の上にカーソルを移動し、関心のタグ付き領域をクリックすることでタグを付けることができます。 （樹状アーバの蛍光画像は、コンピュータの画面上に表示されます。生徒は、コンピュータの画面上で画像の上に場所の番号をマークします。） 光配信のためのパターンをプログラミングオペレータがコンピュータ画面に表示されているパターンは独立した一連の画像として保存されます。各空間パターンのレーザーパルスのタイミングは、データ収集プログラム（pClamp）と統合されているソフトウェアにプログラムされます。 （これを示す）。 DMDパターンにレーザーパルスの調整データ収集プログラムが開始され、ターゲットのニューロンから電気信号をクランプDMDエレクトロニクス、レーザーのゲート、およびパッチの取得のタイミングを調整します。 （コンピュータにこのシーケンスをシミュレートする） 実験データ： 遠位樹状分岐点間の非線形和電極を有する樹枝状の統合は、従来、個別の場所で刺激の振幅を変化させるのではなく、一定の強度を維持しながら刺激の面積を拡大することで行われている。位置依存性チャネルの電気発生と募集の彩度に関係する問題は、結果や結論に影響を及ぼすことができる。分散型樹状刺激は容易にDMDベースのシステム（図4A）を使用して実装することができます。入力強度は、光刺激のスポット数を増やすことによって変化させた。我々はその空間的加重が2つの娘枝に到着増加する入力の振幅とますます超えた線形になる分岐点を越え非線形になることができる見ることができます。上記直線性は、主に電位依存性チャネル（図5）にNMDA受容体を媒介とされていません代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 DMDのマイクロミラーの動作。 （サイドビュー）個々のミラーに向けられた静電気力は、ミラーが2つの可能な方向、水平から12 °のいずれかに傾けることが原因となる。 ONの位置に入射ビームは、チップの光軸に垂直に沿って指示される。 OFFの位置に入射ビームは48 °の軸外に向けられている。ミラー間の薄い隙間に当たる光は24 °の軸外に向けられている。 （トップビュー）の傾きは、ミラーとチップの側面に対して45 °指向です。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。近代的な蛍光顕微鏡の基本的なレイアウト。フィルターキューブは、客観とチューブレンズの間に"無限の空間"内に位置している。カメラにつながると、試料に光をもたらす照明パスが存在する画像のパスがあります。これら2つの光パスのチューブレンズは、通常、設計で、焦点距離が異なります。照明ではなく、イメージング、チューブレンズは、UVスペクトルで動作するように設計されています。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。UVベースのDMDシステムのレイアウト。照明は、UVスペクトル内にある場合、それは紫外線のために補正されているチューブレンズを通して状態にする必要があります。イメージングパスのチューブレンズは、UVのために設計されていません。中継システムは、簡単にアクセス共役像面を作成するために必要です。顕微鏡で異なる共役のイメージプレーンは赤い点線の線でマークされています。一つの画像平面内の明るいパターンは他の共役面に投影されています。イメージング中にサンプルの平面上のパターンは、検出器/カメラ上に投影される。照明用DMDで生成されたパターンは、試料上に投影される。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。可視光DMD投影システムのためのレイアウト。照明光が目に見える範囲内にある場合、それは撮像光路を介してDMD生成された光パターンを実現することが可能です。これは簡単にcommerciで実装することができますらデュアルカメラポートの添付ファイルと適切なダイクロイックミラー。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。システムの横方向の解像度。 （A）蛍光ターゲット上の光学分解能は〜2μmである。 （B）のような樹状突起全体にケージドグルタミン酸の光分解によって測定された効果的な分解能は〜5μmである。上昇距離は、グルタミン酸の拡散と樹状突起の有限幅の組み合わせによるものです。 （C）光分解はシナプス事象の動態を模倣することができます。電圧の家族は、現在の応答が樹状突起に配信光エネルギーの変動に起因するクランプ。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。樹状分岐点間の非線形和。 （）分散入力は2つのサービス樹枝に適用されます。それぞれの電圧の応答を以下に示します。 （B）の刺激は、同時に投与されています。測定された応答（赤のトレース）は、2つの個別の回答（グレーのトレース）の算術和とは異なります。 <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7。Supralinear総和は、NMDA受容体依存性である。 （）APV、選択的NMDA受容体アンタゴニストは、supralinear総和をブロックします。 （B）刺激強度の関係およびNMDA受容体拮抗薬への感受性がプロットされます。

<ol><li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li>
<li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+neurotransmitters%3A+Theory+and+procedures+for+light+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+Technology+Feature%2C+Cell+imaging%3A+Light+activated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li>
<li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li>
<li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbeck%2C+LJ+%22Digital+Light+Processing+and+MEMs%3A+An+overview%22">Digital Light Processing and MEMs: An overview</a>. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

DMDベースの光刺激のアプローチの利点は、ターゲットが比較的大きな面積を占める状況に最も明白である。興味の対象がそのような少数の樹状突起棘のような、非常に小さい場合、シーケンシャルスキャン共焦点、2光子のシステムは、より良いアプローチになる可能性があります。 DMDのアプローチの一つの重要な弱点は、使用可能な光のその非効率的な使用です。利用可能な光の大部分は、必ずしもOFF鏡に向けて使用されていません。 DMDベースのシステムは、最高の可視範囲での動作に適しています。我々は、DMDベースの光刺激システムはoptogenetics実験で採用した重要な影響を与えるだろうと期待しています。

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<table><tbody><tr><td>現代的な正立蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラおよび画像取得ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンピュータおよびデータ収集/インターフェースシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLP Discovery Developer Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALP3 USBインターフェース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 + Optics w/LED</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュアルカメラポートユニット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>355nm 三倍波 NdVO4 レーザー (~1 W)</td><td>DPSS Laser Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザーシャッター Model LS6</td><td>Uniblitz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチモード光ファイバーおよびファイバーストレッチャー Model# 915</td><td>Canadian Instrument and Research, Ltd</td><td></td><td>100 um コア マルチモードファイバー</td></tr><tr><td>マルチモードファイバーランチャー</td><td>Oz Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>信号発生器</td><td></td><td></td><td>最大 50 kHz</td></tr><tr><td>ビームコリメーター</td><td>Olympus Corporation</td><td>DApo20UV340</td><td></td></tr><tr><td>UVリレーレンズ</td><td>Special Optics</td><td>#: 54-25-60-355</td><td></td></tr></tbody></table>

分岐点間での樹の統合を調査するためにデジタルマイクロミラーデバイスと模様の光刺激

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

光は、神経細胞の興奮性を制御するための汎用性と正確な手段です。このようなチャネルロドプシンとケージ神経伝達物質などの光に敏感なエフェクターの最近の導入は、スペースと実験的神経科学のための有用な時間で、光のパターンを制御するためのより良い手段を開発する上での利益につながっている。共焦点、2光子顕微鏡で使用されている1つの従来の戦略は、回折限界のスポットに光を集中し、関心領域で順次にその単一のスポットをスキャンすることです。大きな領域は、短い時間枠の、イメージングのためのより光刺激により適用される問題の中で刺激する必要がある場合は、この手法には問題になります。代替戦略は、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）の助けを借りて、ターゲット上で完全な空間パターンを投影することです。 DMDのアプローチは、ハードウェアコンポーネントが比較的安価であるため魅力的ですし、商業的利益によってサポートされています。そのようなシステムは直立顕微鏡の利用できないため、我々はこのようなDMDシステムの構築と運用に重要な問題を議論します。我々は主に紫外光分解のためにシステムの構築を記述する場合でも、optogeneticの実験のためにはるかに簡単な可視光システムを構築するための修正も提供されます。 UV光分解システムは神経科学における基本的な問題を研究する実験をCARRYOUTするために使用された、どのように空間的に遠位樹状分岐点間で統合の入力を配布されます。結果は、統合が分岐点を越え非線形することができ、超線形の大部分がNMDA受容体によって媒介されることを示唆している。

デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）は、神経細胞の興奮性を制御するために、時間と空間の複雑なパターンを生成することができます。 DMDシステムの設計、建設、および操作に関連する問題について説明します。このようなシステムは、遠位樹状分岐点を越え非線形統合のデモンストレーションを有効にする。

光は、ニューロンの興奮性を制御するための多才かつ精密な手段である。チャネルロドプシンなどの光感受性エフェクターの最近の導入により……

この手順の全体的な目的は、ニューロンを刺激するために、時間的および空間的に複雑な光パターンを制御することです。これはまず、顕微鏡の光路において、DMDチップを適切な共役像面に配置することによって達成されます。手順の第2ステップは、レーザーなどの強力な光源を用いてDMDを適切に照射することです。手順の第3ステップは、コヒーレント照明によるスペックル現象を除去することです。手順の最終ステップは、DMDチップを操作するためのグラフィカルユーザーインターフェースを統合することです。最終的に、DMDシステムを用いたケージド神経伝達物質のマルチサイト光分解により、従来は困難であった実験が比較的容易に達成できることが示されます。こんにちは。メリーランド大学神経科学科のDr. Chaman Tangの研究室に所属しているMichael Mohammedです。今日は、光学顕微鏡を用いて複雑な消去パターンを生成する手順についてご紹介します。当研究室では、樹状突起の統合を研究するためにこの手法を用いています。それでは、開始しましょう。このプロトコールでは、実験神経科学に用いられるデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）照明システムの操作方法を説明します。DMDとは、表面に数十万個の微小な可動ミラーが矩形に配列された光学半導体チップであり、各ミラーの位置が画像のピクセルに対応しています。各ミラーは、2つの方向の間で個別に傾斜制御が可能です。オフの状態では、光は試料照明の光軸から外れる方向に導かれます。オンの状態では、光は光軸に沿って導かれます。DMDは、非常に強力なUV光に耐性があり、オンとオフのピクセル間で高いコントラスト比を生成でき、さらに2つの状態を数十マイクロ秒で切り替えられるため、溶菌に非常に適しています。バイオ医学研究へのDMDの応用は、画像操作ソフトウェアおよびハードウェアが広く普及していることや、画像表示分野における商業的な関心によって促進されています。モジュール式コンポーネントは、Texas Instruments社からDLPディスカバリーキットとして販売されており、これらはDMDを顕微鏡システムに適応させるための支援電子ドライバーを提供しています。顕微鏡光学に関する基本概念を理解する必要があります。現代の基本的な蛍光顕微鏡は、結像光路と照明光路で構成されています。これは、対物レンズ、フィルターキューブ、および結像光路と照明光路のための2つの独立したチューブレンズによって構成されています。この顕微鏡は、試料像面に共役な位置を持つように設計されており、試料面で焦点が合っている物体は、これらの共役像面でも焦点が合って見えます。この概念から導き出される結論として、共役像面で生成された明るい像は、試料像面上にも鮮明に投影されることになります。この手法を用いて、コンピュータで生成した照明パターンを試料上に投影します。レーザービームは非常に明るい光源として機能し、共役像面に配置されたDMDチップ上のマイクロミラーによって実装されたパターンを照射します。DMD照明システムの設計は、可視光波長の光を利用する光遺伝学実験に使用される励起光に依存します。照射されたパターンは、カメラパスを通じて導入することが可能です。したがって、DMDチップはデュアルカメラポートモジュールの2つのカメラポートのいずれかに簡単に取り付けることができます。逆に、ケージ化合物の光分解など、UV領域の光を使用する実験では、光をエピ照明経路に導入し、よりアクセスしやすい共役像面を作成する必要があります。これは、結像チューブレンズがUV透過用に設計されていないためです。その代わりに、照明結像レンズをUV透過に利用し、画像形成において十分な役割を果たさせています。DMD上の各マイクロミラーは、チップの平面に対してプラスまたはマイナスの12度の傾斜を切り替えることができます。コンピュータからのデジタル入力に応じて、回転軸は各ミラーの対角線方向に設定されており、これはチップの矩形辺に対して45度の角度になります。ミラーの傾斜方向は、チップ表面のコーナーにある金色の三角形で示されています。マイクロミラーの傾斜により、入射照明ビームのピッチと方位の調整が決まります。DMDを照明するには、まず照明ビームのピッチをDMDチップの垂直軸から24度に設定し、方位をミラー回転軸に対して垂直に設定します。効率的な動作のためには、精密なビームアライメントが極めて重要です。溶菌実験では、迅速なアンケージングに必要な高強度の集束ビームを生成するために、レーザー光源を使用してください。ここでは、準連続波ダイオード励起固体波長変換（3倍波）Nd:YAGレーザーを使用します。レーザー出力のごく一部しか実際に試料に到達しないため、比較的高出力のレーザーを使用してください。DMDシステムを使用する場合は、レーザー出力をマルチモードファイバーに導入し、DMDを照明するための適切な軸に沿って容易に配置および方向調整ができるようにして、コヒーレント照明によって生じるスペックル問題を解決します。光を光ファイバー経由で透過させてください。ファイバーは、約40 kilohertzで振動するように駆動されるピエゾ電気ファイバーストレッチャーに巻き付けられています。ファイバーを微細に伸長させることで、各光刺激パルスのミリ秒単位の持続時間中にスペックルパターンを何度も移動させることができ、これによりスペックルを効果的に除去しています。最後に、光ファイバーの出力をUV顕微鏡対物レンズでコリメートしてDMDを照射し、CCDピクセルをDMD画像ソフトウェアとコアジストさせました。このソフトウェアは、個々のDMDミラーをイメージングCCDカメラの特定のピクセルに対応させるために作成されました。ソフトウェア内のグラフィカルユーザーインターフェースにより、ユーザーはコンピュータマウスを使用して、CCD画像上の領域に対応するDMDミラーの配向を割り当てることができます。コンピュータ画面に表示された画像上でカーソルを動かして光刺激の位置を指定し、タグ付けされた関心領域をクリックして、光照射パターンの保存をプログラムします。コンピュータ画面上に一連の独立した画像としてマークされたパターンにより、各空間パターンのためのレーザーパルスのタイミングがソフトウェアにプログラムされます。これはデータ収集プログラムであるP clampと統合されます。最後に、データ収集プログラムを使用して、DMD電子回路のタイミング、レーザーのゲーティング、および標的ニューロンからのパッチクランプ電気信号の収集を同期させます。ここでは、光学系分解能のキャリブレーションを示しています。蛍光標的を用いて測定した最小スポットサイズを示します。有効な生理学的解像度は、光刺激の関数として電流流量の振幅により測定されます。スポット位置については、直径2 µmの樹状突起分枝に隣接してケージドグルタミン酸を光分解しました。スポットを移動させた。光刺激の強度を変えて、ダイオードを直交するように走査した際の電気的応答を示す。光強度に対する電位固定応答を図示している。DMDベースのシステムを用いることで、分散的な樹状突起刺激を容易に実装できます。ここでは、2本の樹状突起枝上の円で示された光刺激スポットの数を増やすことにより、入力強度を変化させました。空間的加算は、分岐点において非線形になる可能性があります。2つのドアブランチに到達する入力振幅が増大するにつれて、超線形性がますます強まります。これらの結果は、樹状突起の分岐点における加算が非線形に行われることを明確に示しています。この超線形性は、電位依存性チャネルではなく、主にNMDA受容体によって媒介されています。これは、2つのNMDA受容体拮抗薬であるAPVとMK 8 0 1を適用することで、非線形挙動が大幅に消失することから実証できます。以上で、神経組織のパターン光刺激に用いるDMDベースのシステムの基本的な設計と動作について説明しました。このシステムは、光遺伝学実験などで使用される可視光による刺激にも適応させることが可能です。また、単光子溶解に使用される近紫外光にも適応可能です。この手順を行う際は、波長400 nanometers未満の光を使用し、多くの場合にエピ照明経路を通す場合、照明ビームを数度以内の精度で正確に整合させることが極めて重要であること、およびコヒーレント光を使用する場合はスペックルを効果的に除去する必要があることを念頭に置いてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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