キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物

この手順の全体的な目的は、キネシンモーターでコーティングされた表面上で滑走する微小管にナノスフィアをロードすることです。これは、まずガラスフローセルの表面をカゼイン溶液でコーティングすることで達成されます。手順の第2段階では、キネシンモータータンパク質をフローセル表面に吸着させます。

手順の3番目のステップは、微小管を添加することです。手順の最終ステップは、微小管に結合するストレプトアビジン分子を添加し、その後ナノスフェアを添加することです。ナノスフェアはフローセルの表面に結合し、そこで微小管によって回収されます。

最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、ナノ粒子が微小管に取り込まれ、表面上を輸送される様子を観察できます。こんにちは。私はフロリダ大学材料科学工学科のHenry Hess博士の研究室のElaine Jen Smithです。本日は、逆転運動性アッセイの手順をご紹介します。

当研究室では、微小管へのカーゴの負荷および分子シャトルの移動を研究するために、この手順を用いています。それでは始めていきましょう。この手順を開始する前に、本ビデオの解説部分に記載されている通り、すべてのストック溶液を新たに調製しておいてください。

ストックソリューションの調製後、0.65 milliliterのマイクロ遠心チューブに25 µLの増殖溶液をピペッティングし、マイクロチューブの調製を開始します。次に、20 µgの凍結乾燥ビオチン化チューブリンに6.25 µLの増殖溶液を加えます。溶液をボルテックスし、37 °Cの恒温槽で30分間静置して重合させます。インキュベーション後、溶液をTaxol Bufferで100倍に希釈し、穏やかにボルテックスします。

この溶液は微小管を安定させるために使用します。溶液に「MT 100」とラベルを貼り、室温で保存してください。次に、MT 100をアンチフェードバッファーで10倍に希釈し、この溶液に「MT 1000」とラベルを貼ります。

次に、キネシン溶液をTPバッファーで20倍に希釈して、キネシンモーターを調製します。この溶液にkinase in 20とラベルを貼り、氷上に保存します。最後に、ストレプトアビジン溶液とナノスフィア溶液を調製します。

まず、Antifa Bufferを用いて、Alexa Fluor 5 6 8標識ストレプトアビジンの濃度を100 nano molarsに調製します。この溶液にSTV 100とラベルを貼り、次にナノスフェアをAntifa Bufferで5,000倍に希釈して、この混合液にNS 5,000とラベルを貼ります。これら両方の溶液を氷上で保存します。

カーゴローディングアッセイ用の溶液調製後、カバースライドとガラスカバーグラスを両面テープで離して固定し、フローセルを作製します。まず、カバースライドの両端に2本の両面テープを貼り付け、テープ間に約1 cmの間隔を空けます。次に、そのテープの上にカバーグラスを被せます。

ピンセットの平らな端を用いてカバーガラスに圧力をかけ、密封します。作製されたフローセルは、長さ約2cm、幅約1cm、高さ100µmで、容量は約20µLです。これで倒立アッセイの組み立てを開始します。

ピペットのチップをカバーガラスとスライドガラスの間に配置します。次に、0.5 mg/mL のカゼイン溶液をフローセルに注入します。フローセルをこのようにコーティングすることで、キネシンが吸着した際にもその機能を保持できるようになります。

カゼイン溶液でコーティングされるまで5分間待ちます。次に、ピペットのチップをカバーガラスとスライドガラスの間に配置して、20の溶液でキナーゼをフローセルに導入し、Kinesinを吸着させます。その後、溶液をフローセルの一方から注入し、同時に反対側から吸い出します。

フィルターペーパーを用い、キナーゼinを吸収させるために5分間待ちます。次に、MT 1000溶液をフローセルにピペッティングして、微小管をフローセル内に導入します。微小管がキナーゼinモーターに付着した後は、微小管が沈降し、キナーゼinモーターに結合するまで5分間待ちます。

フローセルにSTV 100溶液を導入し、微小管を蛍光標識strep TTRでコートします。strep TTR分子が微小管に結合するまで5分間待ちます。Antifa溶液を30 µLずつ3回フローセルに導入し、過剰なstrep TTRを洗浄除去します。

最後に、NS 5,000溶液をフローセルにピペッティングし、ビオチン化ポリスチレンフルオレセインナノスフェアを導入します。表面は固定化されます。ナノスフェアは移動する微小管に衝突し、それに結合します。

本実験では、100倍油浸対物レンズ、Xサイト、120Wランプ、およびExon EMCCDカメラを備えたEclipse TE2000U蛍光顕微鏡を使用します。まず、対物レンズの上に浸油を1滴滴下します。次に、Trixyフィルターキューブを用いてフローセルを顕微鏡ステージに固定します。

微小管にピントを合わせ、次いでfitzyフィルターキューブに切り替えてナノ球を観察します。次に、andまたはI exonプログラムを開き、取得モードをkineticに設定します。露光時間は0.5秒、kineticシリーズ長を20、kineticサイクル時間を6秒に設定して使用してください。

顕微鏡の切り替えスイッチを接眼レンズからカメラに切り替え、画像の取得を開始します。最初の4枚の画像では、trixiキューブを使用して微小管を撮影します。続く12枚の画像では、Fitzフィルターキューブに切り替えてナノスフィアの画像を撮影します。

次に、trixiフィルターキューブに切り替えます。微小管を撮影するための最後の4枚の画像では、Trissyフィルターキューブを使用して微小管を観察し、その後、フィルターキューブをfiteに切り替えます。ここでのナノスフィアの可視化において、微小管によって輸送されているナノスフィアを矢印で示しています。すべてのナノスフィアが微小管に捕捉されたわけではありません。

36秒後のナノ球の位置を示すと、ナノ球が移動していることがわかります。再び微小管を撮影すると、微小管自体も視野内を移動していたことが明らかになります。これらの画像は、微小管のシャトリングによってナノ球が変位したことを示しています。

以上で、逆転運動性アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、画像取得中にフィルターキューブを切り替え、微小管とナノスフィアの両方が見えるようにすることが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。