Name: キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶキネシンモーター駆動の分子シャトルシステムにおけるナノスフェアの貨物ロード手法。機能化マイクロチューブルを用いたナノスケール輸送システムの構築と蛍光顕微鏡による観察方法を解説。

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我々は、そのグループその後、当社が適応された滑走運動アッセイのための基本的なプロトコルを開発したジョナサンハワード、に重債務です。 NSFの助成DMR0645023からの財政支援を感謝する。

1）のバッファーと試薬これらのソリューションは事前に準備し、便利なサイズのアリコートに格納する必要があります。アリコートは典型的な実験と新鮮なアリコートを各運動性アッセイのために使用されるための十分な解決策が含まれている必要があります。保存条件と典型的な分量のサイズは、以下のプロトコールに記載されています。 1。 BRB80バッファ、（80mMのPIPES、1mMのMgCl 2、脱イオン蒸留中の1mM EGTA（DD）水、KOHで6.9に調整したpH値） <ul><li> DDの水に0.5 M EGTAの100 mLの原液を作る。 2 M NaOH溶液を用いてpHを7.0に調整する。 </li><li> DDの水の1 M MgCl 2の100 mLの原液を作る。ソリューションをオートクレーブ。 </li><li>パイプとddの水の約800 mLの3.1グラムのKOHペレットの24.2 gを追加し、溶解するかき混ぜる。 1 M KOH溶液を用いて6.9にpHを調整する。 0.5 M EGTAのストック溶液と1 MのMgCl 2ストック溶液を1 mLの2 mlを加え。 DDの水で1000 mlにボリュームを起動します。 </li><li>将来使用するまで-20℃で50mlのファルコンチューブとフリーズに分注し。現在使用されてBRB80チューブを4℃または室温で保存することができます。 </li></ul> 2。塩化マグネシウム、 塩化マグネシウム（DDの水では100mM） <ul><li> 100mMの最終濃度を達成するためにDDの水で希釈する。 </li><li>将来使用するまで-20℃で0.5 mLのマイクロ遠心チューブとストアへのアリコート（10μLボリューム） </li></ul> 3。グアノシン-5' - 三リン酸、二ナトリウム塩、GTP（NaOHで7に調整DD水、pHの25mMの） <ul><li>秤量し、DDの水に溶解し、2 M NaOH溶液でpHを7に調整する。 </li><li> 260 nmでのUV吸光度を測定して濃度を確認します。 （11.7 × 103 M -1 cm -1の吸光係数を使用してください）。 </li><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（10μLボリューム）。 </li></ul> 4。ジメチルスルホキシド、DMSO <ul><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（10μLボリューム）。 </li></ul> 5。タキソール（DMSO中の1mM） <ul><li>秤量および1mMの最終濃度を達成するためにヒュームフードの下にDMSOに溶解する。 </li><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。 </li></ul> 6。 D -（+） - グルコース、（DDの水で2 M） <ul><li>秤量し、2 Mの最終濃度を達成するためにDDの水に溶解</li><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。 </li></ul> 7。グルコースオキシダーゼ、（BRB80 2 mg / mLの） <ul><li>濃度2μg/ mlの最終濃度を達成するためにBRB80に溶ける。 </li><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。 </li></ul> 8。ジチオスレイトール、DTT（DD水で1 M） <ul><li> 1 Mの最終濃度を達成するために換気フードの下のdd水に溶ける</li><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。 </li></ul> 9。カタラーゼ、（BRB80 0.8 mg / mLの） <ul><li> 0.8 mg / mLの最終濃度を達成するために少なくとも2段階でBRB80に溶解する。 276 nmでのUV吸光度を測定し、各段階での濃度と406 nmの（406 nmで276 nmで3.1 × 10 5 M -1 cm -1のと2.2 × 10 5 M -1 cm -1の吸光係数を使用して決定する方程式= CL）。 </li><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。 </li></ul> 10。アデノシン5' -三リン酸、ATP（100mMのMgCl 2の 100 mM）を<ul><li> DDの水に100 mMのMgCl 2ストック溶液を準備します。乾燥粉末を秤量して100mmの最終濃度を達成するためにこのストック溶液に溶解する。 </li><li> 260 nmでのUV吸光度を測定して濃度を確認します。 （15.4 × 10 3 M -1 cm -1の吸光係数を使用してください）。 </li><li> 0.5 mLのマイクロ遠心チューブおよび将来使用するまで-20℃でストアへのアリコート（20μLボリューム）。 </li></ul> 11。カゼイン溶液（BRB80 20 mg / mLのカゼイン） <ul><li> 50mlファルコンチューブに30 mLのDDの水に約3 gのカゼインを追加。解決策が厚い一貫性を開発するまで約1時間ボルテックス。 </li><li> 30分間、約15000グラムで遠心。は0.5μmと0.2μmのシリンジフィルターを通して上清をフィルターします。 </li><li> 280 nmの（0.67 mLの投与-1 cm -1の吸光係数を使用）でのUV吸光度を測定することにより、上清の濃度を決定する。 BRB80 20 mg / mLのためにそれを希釈する。 </li><li>アリコート（20μLボリューム）の0.5mLの微量遠心チューブおよび将来使用するために-20℃で保存する。 </li></ul> 2）標準ソリューションこれらは、実験当日に調製され、実験が終わった後に廃棄されるべきである。各1 mLを準備します。 1。 BRB80CS0.5 <ul><li> BRB80で氷の上は0.5 mg / mLおよび店舗の最終濃度にカゼイン溶液を希釈する。この溶液は、キネシンのフローセルに導入し、表面吸着後のキネシンの活性を保持するのに役立ちますています。 </li></ul> 2。 BRB80CA <ul><li> BRB80と氷の上の店では0.2 mg / mLのカゼインおよび1mM ATPを準備します。キネシンは、さらにフローセルに導入する前にこのソリューションを使用して希釈される。 </li></ul> 3。 BRB80T <ul><li> BRB80で室温にて10μMと店舗の最終濃度にタキソール希薄溶液。このソリューションは、微小管を安定させるために使用されます。 </li></ul> 4。 BRB80CT <ul><li>室温でBRB80と店舗で10μMタキソールおよび0.2 mg / mLのカゼインを準備します。これは、さらに褪色防止と微小管の溶液を調製するために使用されます。 </li></ul> 5。 BRB80AF <ul><li> 20 mMのD -グルコース、20μg/ mLのグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ8μg/ mLと、10mMのDTT、およびBRB80CTで20μMATPと室温でストアを準備します。このソリューションは、ストレプトアビジンとナノスフェアを希釈し、フローセル内に過剰なストレプトアビジンを"洗い流す"ために使用されます。キネシンの速度は、この溶液中のATP濃度を調整することによって制御することができます。 </li></ul> 3）キネシンの準備<ul><li>キネシンを表現するには、大腸菌の野生型、フルレングスのキイロショウジョウバエのキネシン重鎖とC末端His -タグから成る建設し、6に記載のようにNi - NTAカラムを用いて精製する。 </li><li> -80 0.5mLの微量遠心チューブとストア内のアリコート（10μLずつ）を確認·今後の使用のためのC。これらのアリコートに積極的にキネシンの濃度は、約200nmである。7 </li><li>典型的な実験では、キネシンのソリューションをBRB80CAで20倍に希釈する。氷の上のソリューションのKIN20とストアにラベルを付けます。 </li></ul> 4）微小管の準備<ul><li> 0.5mLのマイクロ遠心チューブに、成長溶液25μLを準備：4mMの情報のMgCl 2、1mM GTP及び5％DMSO（v / v）をBRB80バッファに。 </li><li>凍結乾燥ビオチン化チューブリンの20μgのアリコートに、このソリューションの6.25μLを加える。 </li><li> 37熱浴中の渦、その場所°重合するために30分間。優しくBRB80Tとボルテックスで100倍希釈する。室温でのソリューションのMT100とストアにラベルを付けます。 </li><li> BRB80AFのMT100の10倍希釈を行う。ソリューションMT1000にラベルを付けます。 </li></ul> 5）ストレプトアビジンとナノ粒子のソリューション BRB80AF 100 nMの濃度でAlexaFluor568標識ストレプトアビジンを準備します。氷の上にそれがSTV100と店舗ラベルを付けます。同様に、BRB80AFの溶液中でナノ粒子5000倍に希釈する。氷の上にNS5000およびストアにラベルを付けます。 6）フローセルの構造両面テープで区切られた二つのガラス製カバースリップを使用して、フローセルを構築します。このフローセルは、1cm幅および100μmの高い、約2cmの長さで、約20μLの容積を持っています。ソリューションは、ろ紙を使用して、他からピペットと邪悪な外を使って片側からフローセルに導入されています。 7）逆アッセイのアセンブリガラスの表面は、最初のキネシンが吸着時にその機能を保持できるようにするカゼインで被覆されている。キネシンが吸着された後、微小管はキネシンによって保持され、導入されています。微小管は、蛍光ストレプトアビジンでコーティングされています。過剰ストレプトアビジンを洗浄後、ビオチン化ポリスチレン蛍光ナノスフェア（40 nmの直径）が導入されています。表面吸着固定ナノスフェアは移動する微小管に衝突し、それらの（図1）にロードされる。 次のソリューションの導入前に許容されるソリューションと時間の流れの順序は、以下に記載されています。 <ul><li> BRB80CS0.5、5分</li><li> KIN20、5分</li><li> MT1000、5分</li><li> STV100、5分</li><li> BRB80AF、3倍</li><li> NS5000 </li></ul> 8）顕微鏡すぐにナノスフェアの導入後に顕微鏡のステージ上でフローセルをマウントします。この実験で、100倍油浸対物（NA 1.45）、X - Citeの120ラ​​ンプ（EXFO、オンタリオ州、カナダ）およびIXON EMCCDカメラ（ANDOR、装備のEclipse TE2000 - U蛍光顕微鏡（ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州）でサウスウィンザー、コネチカット州）を用いた。 FITCフィルターキューブ（＃48001）とTRITCフィルターキューブ（＃48002、クロマキー技術、ロッキンガム、バーモント州）は、画像のナノ粒子と微小管respectiするために使用されたvelyフローセルの底面。エクスポージャー間の時間は2秒だったしながら露光時間は、0.2秒だった<img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。分子シャトルの概略図。

<ol><li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li>
<li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li>
<li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li>
<li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li>
<li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li>
<li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li>
<li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li>
<li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li>
<li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

マイナーな変更を加えることにより、このプロトコルが正常にキネシン微小管ベースの運動性アッセイを組み立てるためのグループの様々で使用されています。最終的な運動性の溶液中で10mMのDTT、0.5％β-メルカプトエタノールに置き換えることができます。 2時間以上古い標準溶液は（BRB80AF、KIN20とMT1000）に使用しないでください。特にタキソールと微小管を含む任意の溶液を氷の上に配置しないでください。機能部品の光損傷における紫外線励起光の結果にフローセルの過度のエクスポージャー：。微小管とキネシン8フローセルは、ポリスチレンのナノ粒子などの高酸素拡散性を有するポリマーが含まれている場合、この効果はさらに顕著である9。

<table><tbody><tr><td>アデノシン-5&amp;rsquo;-三リン酸 (ATP)</td><td>Invitrogen</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化チューブリン</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333</td><td></td></tr><tr><td>カゼイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0376</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-9322</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7528</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8779</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0610</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノ&amp;#8211;エチルエーテル)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;#8242;,N&amp;#8242;&lt;/em&gt;-四酢酸 (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres ビオチン化マイクロ粒子, 40 nm, 黄緑色蛍光 (505/515)</td><td>Invitrogen</td><td>F-8766</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7016</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン-5&amp;rsquo;-三リン酸 (GTP)</td><td>Roche Group</td><td>106399</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>パクリタキセル (Taxol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸, ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸), ピペラジン-N,N&amp;#8242;-ビス(2-エタンスルホン酸) (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン Alexa Fluor 568 コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>S11226</td><td></td></tr></tbody></table>

キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

細胞は、貨物のアクティブな細胞内輸送をサポートするために、そのようなキネシンモーター蛋白質と微小管のフィラメントとして、洗練された分子機構を進化させてきた。キネシンのテールドメインは、貨物の多様に結合する一方、キネシン頭部ドメインは微小管の格子に沿って進むためにATP分子に保存されている化学エネルギーを利用する。長く、硬い微小管は、長距離細胞内輸送のためのトラックとして機能します。 これらのモータとフィラメントはまた、分子シャトル1の構成要素として、微細加工、合成環境で使用することができる。頻繁に使用する設計では、キネシンモーターはその尾を介して路面に固定されています、そして、官能微小管は、これらのモーターによって推進されている要素を、運ぶ貨物として役立つ。これらのシャトルは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の強力かつ選択的結合を利用して貨物をロードすることができます。主要コンポーネントは、（ビオチン化チューブリン、ストレプトアビジン、およびビオチン化貨物）市販されている。 古典的な反転運動性アッセイ2で構築し、分子シャトルの建設は、ここで詳しく説明されています。キネシンモーター蛋白質はカゼインでプレコート表面に吸着され、微小管は、ビオチン化チューブリンから重合したキネシンに付着し、その後、ローダミン標識ストレプトアビジンでコーティングされています。 ATP濃度は、貨物3をロードするための最適な微小管の滑走速度を達成するためにsubsaturatingの濃度で維持されます。最後に、ビオチン化フルオレセイン標識ナノスフェアは、貨物として追加されます。ナノスフェアは、表面に付着したグライダーの微小管とナノ粒子間の衝突の結果として微小管に接続します。 プロトコルは、容易にこのようなビオチン化DNA 4、量子ドット5またはビオチン化抗体を4から6を介して抗原の多種多彩な貨物の様々なを読み込むように変更することができます。

に滑走の官能微小管から成る分子シャトルの表面に付着キネシンモータータンパク質は、ナノスケールの交通システムとして機能することができます。ここで、典型的なシャトルのシステムのアセンブリが​​記述されています。

細胞は、キネシンモータータンパク質や微小管フィラメントなどの洗練された分子機構を進化させ、能動的な細胞内輸送を維持しています...

本手順の全体的な目的は、キネシンモーターでコーティングされた表面上で滑走する微小管にナノ粒子をロードすることです。まず、ガラス製フローセルの表面をカゼイン溶液でコーティングします。次に、フローセル表面にキネシンモータータンパク質を吸着させます。手順の3番目のステップは、微小管を添加することです。手順の最終ステップは、微小管に結合するストレプトアビジン分子を添加し、次にナノスフェアを添加することです。ナノスフェアはフローセル表面に結合し、そこで微小管によって回収されます。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、ナノ粒子が微小管に取り込まれ、表面を横切って輸送される様子を観察することができます。こんにちは。私はフロリダ大学材料科学工学科のHenry Hess博士の研究室から来ました、Elaine Jen Smithです。本日は、反転運動性アッセイの手順をご紹介します。当研究室では、微小管へのカーゴのローディングおよび分子シャトルの移動を研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。この手順を開始する前に、本ビデオの解説資料に記載されている通り、すべてのストック溶液を新しく調製してください。ストック溶液を調製した後、0.65 mL マイクロ遠心チューブに成長溶液を 25 µL ピペッティングして、微小管の調製を開始します。次に、20 µg の凍結乾燥ビオチン化チューブリンに成長溶液を 6.25 µL 加えます。溶液をボルテックスし、37 °C の恒温槽に 30 分間置いて重合させます。インキュベーション後、溶液を Taxol Buffer で 100 倍に希釈し、穏やかにボルテックスします。この溶液は微小管を安定化させるためのものです。溶液に「MT 100」とラベルを貼り、室温で保存してください。次に、MT 100をアンチフェードバッファーで10倍に希釈し、この溶液に「MT 1000」とラベルを貼ります。次に、キネシン溶液をTPバッファーで20倍に希釈して、キネシンモーターを調製します。この溶液に「kinase in 20」とラベルを貼り、氷上で保存します。最後に、ストレプトアビジン溶液とナノスフィア溶液を作製します。まず、Antifa Bufferを用いて、Alexa Fluor 5 6 8標識ストレプトアビジンの濃度を100 nano molarsに調製します。この溶液にSTV 100とラベルを付けます。次に、ナノスフィアをAntifa Bufferで5,000倍に希釈し、この混合液にNS 5,000とラベルを付けます。これら両方の溶液を氷上で保存します。カーゴローディングアッセイ用の溶液調製後、カバースライドとガラスカバーガラスを両面テープで分離させてフローセルを作製します。まず、カバースライドの両端に2本の両面テープを貼り付け、テープの間に約1 cm

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生物学

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「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖（KIF5B）のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。...

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