Name: マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶマイクロアレイを用いたtRNAアミノアシル化レベルのゲノムワイド解析法。Saccharomyces cerevisiaeを用いてストレス応答におけるタンパク質合成効率の変化を評価し、翻訳制御メカニズムの理解に貢献する。

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パンの実験室での酵母の作業は、味の素（株）日本衛生研修グラントT32GM007183 - 33の国立研究所からの助成金によって賄われていた。我々は、酵母のプロジェクトの長期的協力のための医学のインディアナ大学で博士ロナルドWekに感謝。我々はまた、マイクロアレイ法を充電tRNAを開発するための博士キンバリーディトマーに感謝。

パート1：総荷電tRNAの分離<ol><li> 5分2000 RFCで卓上遠心機で細胞をペレット化する。細胞のOD 600 1の等価ではトータルRNAの少なくとも1μgのを生成する必要がありますおよび30μgの最小値は、プロシージャをお勧めします。 </li><li> 0.3 Mから成る溶解緩衝液に再懸濁し、細胞は+ -酢酸（pH4.5）を、10 mMのEDTA Naはバッファ。 30秒に3回各液（pH4.5）のNa + -酢酸飽和フェノール/クロロホルム等量の持つ渦常にボルテックスの間に氷上でサンプルを保管してください。フェノール/クロロホルム飽和酢酸を1部5 Mを混合して調製することができますがバッファリングされた酢酸はNaOACとのHOAcから調製することができる9部フェノール/クロロホルムと酢酸（pHは4.5）バッファ。 注：トータルRNAの分離は、荷電tRNAの脱アシル化を避けるために穏やかな酸性条件下で、氷上で行われる。 </li><li> 4℃で15分間18600 RFC℃で遠心水層を取り外し、別の酢酸飽和フェノール/クロロホルム抽出を行います。 </li><li> 2回目の抽出後は4℃で30分間RFC 18600でエタノール及び遠心分離の2.7倍のボリュームを追加することによりRNAを沈殿℃を</li><li>溶解緩衝液にして、懸濁しますRNAペレットは、エタノールで2回目を沈殿させる。 </li><li>最後に、10mMのバッファ酢酸（pH4.5）を、その後の治療のために1mMのEDTAを含む溶液中でRNAを懸濁します。サンプルを安定的に約2週間-80℃で保存することができます。いくつかの荷電tRNAはアシル基を除去するために開始されるように長期保存が推奨されていません。 </li></ol>パート2：tRNAの標準の調製<ol><li>熱E. 10.5μM〜85 2分の45 mMのトリス- ClのpHが7.5 ° Cでの大腸菌のtRNA規格。チューブを取り出し、3分間室温でおきます。 </li><li> 37℃の20mMとインキュベートの最終濃度℃で5分間にMgCl 2を追加。 </li><li>最後の反応は5μMtRNAは、60mMのトリス- HCl（pH 7.5）、12.5 mMのMgCl 2、10mMのKClを、3 mMジチオスレイトール、1.5mMのATP、1mMのスペルミン、それぞれの1mMのが含まれているので、合成反応ミックスを追加アミノ酸、および4.2ユニット/μlE.大腸菌アミノアシルtRNA合成酵素ミックス。 37℃で15分間。 </li><li> 0.5 Mバッファ酢酸（pH4.5）を等量のを追加し、pHを4.5に酢酸飽和クロロホルム/フェノール3で抽出する。 </li><li> 4℃で30分間18600 RFC℃でエタノール及び遠心分離の2.7倍のボリュームを持つtRNAの基準を沈殿させる</li><li>最大1ヶ月間-80℃で1mMのEDTA及び店舗° Cと50 mMのバッファ酢酸（pH4.5）に規格を再懸濁します。 </li></ol>パート3：tRNAのCy3/Cy5ラベリング<ol><li>荷電tRNAのサンプルでは各E.は 0.066μMでは0.1μg/μlの濃度でトータルRNAをインキュベート室温で30分間、50mMのNaIO4の存在下で大腸菌 tRNAの基準（すなわち、0.67ピコモルμgのトータルRNAあたりの各標準）と100 mMのバッファ酢酸（pH4.5）を。コントロールトータルのtRNAサンプルについてNaIO4の代わりのNaCl 50mMのを使用してください。充電を保つためにのみ緩衝液でRNAを希釈することを忘れないでください。 </li><li>反応をクエンチするためには、100mMのためにグルコースを追加し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>サンプルから、残りのNaIO4を削除するG25スピンカラムを用いてバッファー交換を行うためには。最良の結果は、サンプルを適用する前に、それを介して200 mMのバッファ酢酸緩衝液（pH4.5）を実行して、最初のカラムを平衡化するため。 </li><li> 66 mMにエタノールの2.7倍のボリュームの最終濃度〜133 mMのNaClの最終濃度に緩衝酢酸液（pH4.5）を加えることでサンプルを沈殿させる。時折2回目の沈殿は、酸化試料のために必要になる場合があります。これは、ペレットは、同じサンプルの制御ペレットよりも大幅に違って見える場合にのみ必要です。たとえば、かなり大きなもの以上のびまん性ペレット。第二エタノール沈殿を50mM酢酸緩衝液（pH4.5）とエタノールの添加前にNaClを200mMのでペレットを再懸濁しますを必要としている場合。 </li><li>脱アシル化のためのtRNA試料を50mMトリス- HCl（pH 9）と37℃で30分間再懸濁する。反応は、50mMのバッファ酢酸液（pH4.5）と100mMのNaCl、等量の添加により中和される。エタノールの2.7倍のボリュームに沈殿する。沈殿後、RNAを〜1μg/μLの水に再懸濁されている。制御と酸化サンプルの両方がRNAの品質をチェックするためにアガロースゲル上で実行する必要があります。 </li><li> tRNAは0.1μgの上に蛍光オリゴタグを添付するには/μlを脱アシル化されたRNAは、1 ×リガーゼバッファー、15％DMSO、4μMのCy3 -またはCy5を含むオリゴヌクレオチドを​​、0.5単位/μlのT4 DNAリガーゼ、及び酵母エキソ - ホスファターゼ（5,000でインキュベートする16のユニット/μl）（H 16以上）℃で一晩。エキソ - ホスファターゼは、酵母から得られた試​​料のためだけに必要で、omitteすることができますDこのプロトコルは、E.のために使用されている場合大腸菌やヒトサンプル。 </li><li>ライゲーションサンプルを、50mM KOAc液（pH7）の4巻、200mMのKClで混合し、フェノール/クロロホルムの等量で抽出された後。水相の抽出に続いて、RNA調製物をエタノールで沈殿されており、約は0.1μg/μlに水に再懸濁した。 </li><li>ライゲーション効率は、7M尿素を含む12％ポリアクリルアミドゲル上で試料の5-10％を実行することによって評価し、蛍光ゲルスキャナーで視覚化することができます。このPAGE分析では、マイクロアレイハイブリダイゼーションに必要な量の酸化およびコントロールサンプルを決定するためにも有用です。良いライゲーションの結果は〜Cy3/Cy5含有オリゴヌクレオチドの10％以上がtRNAにライゲートされて表示されるはずです。良い標識効率を持つサンプルを、サンプルあたり0.1〜0.5μgのトータルRNAをアレイハイブリダイゼーションに使用されます。 </li></ol>パート4：マイクロアレイのハイブリダイゼーションおよび分析<ol><li>ハイブリダイゼーションマイクロアレイスライドの前には、未結合のオリゴヌクレオチドを​​除去するために1〜2分間蒸留水で煮沸されています。 </li><li> Cy3/Cy5標識サンプルは、ハイブリダイゼーション緩衝液および70μg/ mlの最終濃度は140μg/ mlのポリ（）の最終濃度にサケ精子DNAを140μlで結合されます。 </li><li>ハイブリダイゼーションのプログラム、（表1）は、自動配列のhybridizer上で実行されます。 tRNAの作業では、それは非常にマニュアルハイブリダイゼーションは、高いバックグラウンドを生成するので、自動ハイブリダイゼーションのマシンを使用することをお勧めします。 </li><li>プログラムが完了した後に手動で軽く3〜5分、50 mlコニカルチューブに振盪することによって、少なくとも二回洗浄3水溶液でスライドを洗浄する。 </li><li>スライドは5〜10分間、200未満RFC、低速で遠心分離することによって乾燥させることができる。それは、光への曝露が漂白剤のフルオロフォアを意志ので、光のスライドを保つことが重要です。 </li><li>スライドを乾燥された後、彼らは、最適な結果を得るためにすぐにスキャンする必要があります。必要に応じてそれらは室温で乾燥した暗い場所で数日間保存することができます。スライドは、画像品質の顕著な劣化なしで2〜3回スキャンすることができます。 </li></ol>パート5：代表的な結果 2の近傍でOD 280比率：適切に絶縁されたときにトータルRNAサンプルは、OD 260と非常にきれいなスペクトルを生成する必要があります。は、検出可能なタンパク質またはフェノール汚染はないはずです。 1％アガロースゲル上で実行すると、強力なtRNAのバンドは、生物間の様々な他の可能な核酸のバンドで観測する必要があります。酸化後に清浄なtRNAのバンドが観察されるべきである。サンプルが他のサンプルまたは不鮮明に比べ著しく弱いことが認められた場合、サンプルはマイクロアレイには使用しないでください。マイクロアレイは、最も弱いtRNAのプローブよりも低い一桁ですが非常に低いバックグラウンドを持つ必要があります。高いバックグラウンドは、通常の洗浄工程の間に問題があるためです。これは通常、新鮮な洗浄溶液を調製し、徹底的に残留し、沈殿したSDSを除去するためにすべての機器や配管を洗浄することにより固定することができます。 <table border="1"><tbody><tr><td>ステップ</td><td>詳細</td></tr><tr><td> O -リングの調整</td><td> 75 ° C、2分</td></tr><tr><td>サンプルを紹介</td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td>変性のサンプル</td><td> 90 ° C、5分</td></tr><tr><td>交配</td><td> 60 ° C、16H </td></tr><tr><td> 1を洗う</td><td> 50 ° C、流量の10秒が20を保持する</td></tr><tr><td> 2を洗う</td><td> 42 ° C、流量の10秒が20を保持する</td></tr><tr><td> 3を洗う</td><td> 42 ° C、流量の10秒が20を保持する</td></tr></tbody></table> 表1：ハイブリダイゼーションのプロトコール

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、同時にゲノムスケールでのすべてのtRNAの相対的な充電レベルを決定するための方法を提示する。ここで紹介するプロトコルは、S.用に最適化されています出芽酵母 、そしてそれはまた、正常E.でtRNAの充電プロファイルを測定するために使用されています大腸菌やヒトの培養細胞。それは全体の荷電tRNAを得られる限り、知られているゲノム配列（全tRNA遺伝子の注釈を可能にする）と任意の生物を収容するように変更することができます。

<table><tbody><tr><td>Microspin G-25 コラム</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; アミノアシルtRNA合成酵素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Hyb4 ステーション</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B スキャナー</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロアレイを用いたtrnaのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNAのアミノアシル化、または充電、レベルは急速に環境[1]に応答して細胞内で変更することができます。原核生物と真核細胞の両方におけるtRNAの充電レベルの変化は、ストレス応答の主要な細胞機構である翻訳調節につながる。身近な例では、緊縮応答になります<em&gt; E.大腸菌</em&gt;と酵母のGCN2ストレス応答経路（[2-6]）。の最近の仕事<em&gt; E.大腸菌</em&gt;と<em&gt; S.出芽酵母</em&gt; tRNAの充電パターンは非常に動的であり、細胞を[1、6、7]が経験するストレスの種類に依存していることを示している。 tRNAの充電の非常に動的、変数の性質は完全に環境変化に対する細胞応答を解明するために、ゲノムスケールでのtRNAの充電レベルの変化を決定することが不可欠です。このレビューでは、同時に内のすべてのtRNAの相対的な充電レベルを測定するための方法を提示<em&gt; S.出芽酵母</em&gt;。ここで紹介するプロトコールは酵母のためですが、このプロトコルが正常にを含む生物の様々な相対的な充電レベルを決定するために適用されています<em&gt; E.大腸菌</em&gt;と人間の細胞培養[7、8]。

私達はからすべてのtRNAの相対的アミノアシル化レベルを決定するためにマイクロアレイ解析のための方法を説明します。<em&gt; S. cerivisiae。</em

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

tRNAのアミノアシル化（チャージング）レベルは、環境に応じて細胞内で急速に変化し得ます[1]。...におけるtRNAチャージングレベルの変化は、

本実験の全体的な目的は、tRNAのチャージングレベルの相対的な変化を決定することです。これは、チャージングレベルを維持したままtRNAを単離するために、処理前後の低pH条件下でRNAを単離することによって達成されます。第2ステップとして、RNAに過ヨウ酸酸化処理を施すことで、相対的なチャージングレベルの決定が可能になります。次に、サンプルを蛍光オリゴヌクレオチドにライゲーションし、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーションさせて、A-T-R-N-Aチャージングの結果によるライゲーションレベルの変化を測定します。これは、TRNAマイクロアレイ技術に基づいた、CHOゲノムレベルにおけるTRNAチャージングの変化です。こんにちは、シカゴ大学生化学・分子生物学部のDRT Pan研究室のJohn Zaiです。本日は、ゲノムレベルでチャージされたtRNAを単離し、定量するための手順をご紹介します。当研究室では、ストレス負荷時のtRNAチャージの変化を測定するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。TRNAへの総電荷を単離するには、まず酵母細胞を最低でもOD 600が30相当まで培養します。これにより30 µgの全RNAが生成されるはずです。卓上遠心分離機で細胞をペレット化し、溶解バッファー溶液で再懸濁します。等量の酢酸ナトリウムと飽和フェノール・クロロホルムを加え、30秒間ボルテックスした後、少なくとも30秒間氷上に置きます。ボルテックス処理と分注をさらに2回繰り返します。サンプルを4°Cで15分間、18,600 RFCで遠心分離します。その後、水層を除去し、2回目の抽出後に、酢酸飽和フェニルクロロホルム抽出を再度行います。2.7倍量のエタノールを加え、4 °Cで18,600 RFCにて30分間遠心分離し、RNAを沈殿させます。RNAペレットを溶解バッファー溶液で再懸濁し、再度エタノールで沈殿させます。最後に、後続の処理のために、10 mM 緩衝酢酸および1 mM EDTAを含む溶液にRNAを再懸濁します。サンプルは-80°Cでさらに約2週間安定して保存することが可能です。ただし、一部のチャージされたtRNAは、S3またはSCI5蛍光オリゴヌクレオチドタグによる標識前に分解し始めるため、長期保存は推奨されません。全tRNAにぺリオデート酸化処理を施すことで、相対的なチャージレベルの決定が可能になります。全RNAを、各0.066 µMのeco-tRNA標準物質および100 mM酢酸緩衝液で混合し、50 mM過ヨウ素酸ナトリウム（sodium periodate）を添加します。酸化処理を行わないコントロールtRNAサンプルについては、過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに50 mM塩化ナトリウムを使用してください。反応液を室温で30分間インキュベートし、その後、グルコースを100 millimolarになるように添加して、室温で5分間インキュベートして反応を停止させます。反応の停止後、G 25スピンカラムを用いてバッファー交換を行い、サンプルから残存しているナトリウムピロリン酸を除去します。緩衝酢酸を最終濃度133 millimolar、塩化ナトリウムを最終濃度66 millimolarになるように添加し、さらに2.7倍量のエタノールを加えてサンプルを沈殿させます。次に、Resusを用いてtRNAサンプルを単離し、50 millimolar tris HCLに懸濁させ、37 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。30分後、等量の50 millimolar緩衝酢酸および100 millimolar塩化ナトリウムを加えて反応を中和し、2.7倍量のエタノールで沈殿させます。RNAペレットを水に再懸濁し、濃度を約1 microgram per microliterに調整します。アガロースゲル電気泳動によりコントロールサンプルおよび酸化サンプルのRNA品質を確認した後、tRNAに蛍光オリゴタグを付加するための蛍光標識に進みます。0.1 µg/µLの脱アシルRNAを、4 µMのSI3またはSI5（オリゴヌクレオチドを含む）、ライゲーションバッファー、15% DMSO、0.5 U/µLのT4 DNAリガーゼ、および酵母エキソヌクレアーゼホスファターゼと混合し、16 °Cで16時間以上インキュベートします。ライゲーション後、サンプルに4倍量の酢酸カリウムおよび塩化カリウムを混合し、等量のフェノール・クロロフォームで抽出します。水相を抽出した後、エタノールを用いてRNA調製物を沈殿させます。最後に、ハイブリダイゼーションの前に、RNAペレットを水に再懸濁して約0.1 µg/µLにします。その後、マイクロアレイスライドを蒸留水で1〜2分間洗浄し、未結合のオリゴヌクレオチドを除去します。次に、S3またはSCIの5つの標識サンプルを、最終濃度が140 µg/mLとなるサモン精子DNAおよび最終濃度が7 µg/mLとなるpoly Aを含む140 µLのハイブリダイゼーションバッファーと混合し、自動アレイハイブリダイザーでハイブリダイゼーションプログラムを実行します。手動でのハイブリダイゼーションはバックグラウンドが高くなるため、tRNAの解析には自動ハイブリダイゼーション装置の使用を強く推奨します。ハイブリダイゼーションプログラムの完了後、スライドを50 mLコニカルチューブに入れ、3〜5分間ゆっくりと振盪させることで、wash 3溶液を用いて手動で洗浄します。アルミホイルで事前に包んだチューブ内で、スライドを少なくとも2回洗浄します。最適な結果を得るために、低速で5〜10分間遠心分離してスライドを乾燥させます。スライドは乾燥後、すぐにスキャンする必要があります。スライドは、画像品質に顕著な劣化なく2〜3回スキャンすることが可能です。ここでは、適切に単離された全RNAサンプルとその分析の代表的な結果を示します。このサンプルは非常にクリアなスペクトルを示し、OD 260/OD 280比は2に近く、1%アガロースゲルで電気泳動した際にタンパク質やフェノールの混入は検出されませんでした。酸化サンプルとコントロールサンプルの両方で強いtRNAバンドが観察されるはずであり、それ以外の核酸バンドは生物種によって異なります。サンプルが他のサンプルに比べて明らかに弱かったり、スミアリングが観察されたりする場合は、そのサンプルをマイクロアレイに使用してはいけません。マイクロアレイのバックグラウンドは非常に低く、最も弱いTRNAプローブよりも1桁低い必要があります。この手順において、TRNAを単離し、相対的なチャージレベルを決定する方法を説明しました。特に酸化および希釈のステップにおいて、試薬にヌクレアーゼが混入しないようにすることが重要です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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