マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

本実験の全体的な目的は、tRNAのチャージングレベルの相対的な変化を決定することです。これは、チャージングレベルを維持したままtRNAを単離するために、処理前後の低pH条件下でRNAを単離することによって達成されます。第2ステップとして、RNAに過ヨウ酸酸化処理を施すことで、相対的なチャージングレベルの決定が可能になります。

次に、サンプルを蛍光オリゴヌクレオチドにライゲーションし、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーションさせて、A-T-R-N-Aチャージングの結果によるライゲーションレベルの変化を測定します。これは、TRNAマイクロアレイ技術に基づいた、CHOゲノムレベルにおけるTRNAチャージングの変化です。こんにちは、シカゴ大学生化学・分子生物学部のDRT Pan研究室のJohn Zaiです。

本日は、ゲノムレベルでチャージされたtRNAを単離し、定量するための手順をご紹介します。当研究室では、ストレス負荷時のtRNAチャージの変化を測定するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。

TRNAへの総電荷を単離するには、まず酵母細胞を最低でもOD 600が30相当まで培養します。これにより30 µgの全RNAが生成されるはずです。卓上遠心分離機で細胞をペレット化し、溶解バッファー溶液で再懸濁します。等量の酢酸ナトリウムと飽和フェノール・クロロホルムを加え、30秒間ボルテックスした後、少なくとも30秒間氷上に置きます。

ボルテックス処理と分注をさらに2回繰り返します。サンプルを4°Cで15分間、18,600 RFCで遠心分離します。その後、水層を除去し、2回目の抽出後に、酢酸飽和フェニルクロロホルム抽出を再度行います。

2.7倍量のエタノールを加え、4 °Cで18,600 RFCにて30分間遠心分離し、RNAを沈殿させます。RNAペレットを溶解バッファー溶液で再懸濁し、再度エタノールで沈殿させます。最後に、後続の処理のために、10 mM 緩衝酢酸および1 mM EDTAを含む溶液にRNAを再懸濁します。

サンプルは-80°Cでさらに約2週間安定して保存することが可能です。ただし、一部のチャージされたtRNAは、S3またはSCI5蛍光オリゴヌクレオチドタグによる標識前に分解し始めるため、長期保存は推奨されません。全tRNAにぺリオデート酸化処理を施すことで、相対的なチャージレベルの決定が可能になります。全RNAを、各0.066 µMのeco-tRNA標準物質および100 mM酢酸緩衝液で混合し、50 mM過ヨウ素酸ナトリウム（sodium periodate）を添加します。酸化処理を行わないコントロールtRNAサンプルについては、過ヨウ素酸ナトリウムの代わりに50 mM塩化ナトリウムを使用してください。

反応液を室温で30分間インキュベートし、その後、グルコースを100 millimolarになるように添加して、室温で5分間インキュベートして反応を停止させます。反応の停止後、G 25スピンカラムを用いてバッファー交換を行い、サンプルから残存しているナトリウムピロリン酸を除去します。緩衝酢酸を最終濃度133 millimolar、塩化ナトリウムを最終濃度66 millimolarになるように添加し、さらに2.7倍量のエタノールを加えてサンプルを沈殿させます。

次に、Resusを用いてtRNAサンプルを単離し、50 millimolar tris HCLに懸濁させ、37 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。30分後、等量の50 millimolar緩衝酢酸および100 millimolar塩化ナトリウムを加えて反応を中和し、2.7倍量のエタノールで沈殿させます。RNAペレットを水に再懸濁し、濃度を約1 microgram per microliterに調整します。

アガロースゲル電気泳動によりコントロールサンプルおよび酸化サンプルのRNA品質を確認した後、tRNAに蛍光オリゴタグを付加するための蛍光標識に進みます。0.1 µg/µLの脱アシルRNAを、4 µMのSI3またはSI5（オリゴヌクレオチドを含む）、ライゲーションバッファー、15% DMSO、0.5 U/µLのT4 DNAリガーゼ、および酵母エキソヌクレアーゼホスファターゼと混合し、16 °Cで16時間以上インキュベートします。ライゲーション後、サンプルに4倍量の酢酸カリウムおよび塩化カリウムを混合し、等量のフェノール・クロロフォームで抽出します。水相を抽出した後、エタノールを用いてRNA調製物を沈殿させます。最後に、ハイブリダイゼーションの前に、RNAペレットを水に再懸濁して約0.1 µg/µLにします。その後、マイクロアレイスライドを蒸留水で1〜2分間洗浄し、未結合のオリゴヌクレオチドを除去します。

次に、S3またはSCIの5つの標識サンプルを、最終濃度が140 µg/mLとなるサモン精子DNAおよび最終濃度が7 µg/mLとなるpoly Aを含む140 µLのハイブリダイゼーションバッファーと混合し、自動アレイハイブリダイザーでハイブリダイゼーションプログラムを実行します。手動でのハイブリダイゼーションはバックグラウンドが高くなるため、tRNAの解析には自動ハイブリダイゼーション装置の使用を強く推奨します。ハイブリダイゼーションプログラムの完了後、スライドを50 mLコニカルチューブに入れ、3〜5分間ゆっくりと振盪させることで、wash 3溶液を用いて手動で洗浄します。

アルミホイルで事前に包んだチューブ内で、スライドを少なくとも2回洗浄します。最適な結果を得るために、低速で5〜10分間遠心分離してスライドを乾燥させます。スライドは乾燥後、すぐにスキャンする必要があります。

スライドは、画像品質に顕著な劣化なく2〜3回スキャンすることが可能です。ここでは、適切に単離された全RNAサンプルとその分析の代表的な結果を示します。このサンプルは非常にクリアなスペクトルを示し、OD 260/OD 280比は2に近く、1%アガロースゲルで電気泳動した際にタンパク質やフェノールの混入は検出されませんでした。酸化サンプルとコントロールサンプルの両方で強いtRNAバンドが観察されるはずであり、それ以外の核酸バンドは生物種によって異なります。

サンプルが他のサンプルに比べて明らかに弱かったり、スミアリングが観察されたりする場合は、そのサンプルをマイクロアレイに使用してはいけません。マイクロアレイのバックグラウンドは非常に低く、最も弱いTRNAプローブよりも1桁低い必要があります。この手順において、TRNAを単離し、相対的なチャージレベルを決定する方法を説明しました。

特に酸化および希釈のステップにおいて、試薬にヌクレアーゼが混入しないようにすることが重要です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。