Name: トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶXenopus laevisトランスジェニック作成法。精子核の分離、制限酵素によるトランスジェン統合、核移植を用いて非キメラ胚を効率的に作製し、発生生物学における遺伝子発現研究に活用する方法です。

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このトランスジェネシスの手法の修正版は、当初1および2に記載された。 A.精子核の準備この核の調製法は、マレー3から適合されているが、それらは精子の核を移植した卵のその後の発展を妨げるとして、プロテアーゼ阻害剤が省略されている。アリコートを-80℃で凍結されており、約6ヶ月間の移植に使用することができます。 すべての溶液を調製し、事前の準備を始めるために氷の上に配置する必要があります。 <ol><li> 1月2日、成人男性のXを麻酔少なくとも20分間Tricaineの浸漬によるツメガエルは、ピッシングが続く、精巣を削除します。 </li><li> 、血液、血管や脂肪体を除去1XMMRを含む60ミリメートルペトリ皿の中で簡単にそれらを洗浄し、脂肪体の任意の追加部分を削除するには、ペーパータオル上で睾丸を転がし。これは精子を解放するように、穿刺睾丸をしないように注意してください。 </li><li>目に見える塊がなくなるまで乾燥した60mmのペトリ皿やピンセットを用い、温浸法精巣に精巣を転送します。マセラシオンは、原子核の高収率を得ることなど、徹底的に可能な限り実行する必要があります。 </li><li>温浸法に優しく上下にピペッティングし、2mLs冷たい核準備のバッファを（1X株式からNPB）を追加します。 </li><li>約4を介して噴出柔らかくするには、15 mLの試験管（例えばファルコン2059年）に収集し、漏斗にチーズクロスの厚さは、NPBの8mLsで皿を洗い、これはチューブでそれを収集し、チーズクロスを介してリンス置く。手袋をはめた手でチューブに残った液を収集するために寒冷紗を絞る。 </li><li>ペレットを10分間3000rpmで精子。 4℃で適当なチューブアダプター付きスイングバケットローター（ソーバルHB - 4ローターまたは同等の例：1480グラム）のC。上清をデカントし、このチューブのアドオン8mL NPBとペレットを再懸濁します〜10 mLのピペットでピペッティングし、上下、上記と上清をデカントとして再度スピンダウン。スピン中に室温にNPBの1mLの平衡化させます。 </li><li> 1 mLのpipettemanヒントを使用して1mLの室温のNPBでペレットを再懸濁しますは、10mg/mLたてリゾレシチン50μlの追加、穏やかに混合し、5分間インキュベートする。室温で。 </li><li>リゾレシチンの反応を停止させるチューブに10 mLの冷1XNPB +3％BSAを追加する、穏やかに混合し、スイングバケットローターで3000rpmで10分間スピンダウン。デカント上清。リゾレシチン処理されたペレットは、前のリゾレシチンの治療に比べ（以下不透明な白）やや透明になるはずです。 </li><li> 5mLの冷NPB 0.3パーセントBSAの上清をデカントし、ペレットを再懸濁しますは、10 mLのピペットで静かに混和し、上記のように3000rpmの時に10分間スピンダウン。 </li><li>精子の保存バッファーおよび1.5 mlチューブへの転送の500μLの上清をデカントし、ペレットを再懸濁します。これはあなたの原子核の株式です。あなたが原子核の利回りをチェックしながら氷の上に保管してください。 </li><li>場所、精子の希釈バッファー（SDB）、核株式及び1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにヘキスト社の株式の100倍希釈液1μlの1μlの98μlを核の収率を確認するには。わずか1μlを削除する前に、かみそり、クリップ（または大開口部）ピペットチップを使用して非常によく核株式を混ぜる。非常によく希釈SDB /ヘキスト/核を混合し、毛管現象によって改良されたノイの血球計算盤のチャンバー内に流入し、少量を許可する。化合物の顕微鏡下で血球計算盤の正方形の核を数える。ある男性から、1 - 2X10 5細胞/μlの希釈していない株式の濃度の在庫のこの1:100希釈のために少なくとも100から200（X10 4細胞/ ml）のカウントを取得する必要があります。あなたの在庫が少なく集中の場合、原子核は、数時間のために解決上清の一部を削除し、再集計ができます。 4で核を残す° Cグリセロールがより凍結保存のために浸透できるようにするために一晩、その後、大オリフィスピペットの先端でよく核株式をミックス20μlのアリコートを準備し、そして液体窒素で凍結。 </li></ol>高速抽出のB.の準備このメソッドは、マレー3から適応され、追加された精子の核の膨潤および部分的なクロマチンの脱凝縮を促進する相間細胞質抽出液を生成される。抽出液は、-80℃で小分けで凍結し、使用前に解凍することができます。 <ol><li> HCG注射、素数8月12日大人の女性のXの前に3-5日背側リンパ嚢にPMSGの50 Uを注入することにより、 ツメガエル 。エキスの準備前の晩、2リットルの1XMMRに500台HCGと場所2カエル/コンテナで各カエルを注入する。卵を溶解または活性化するワンカエルのエキスの準備を危険にさらすことができるので、排卵のためにペアにカエルを分離することをお勧めします。 </li><li>翌朝、準備し、準備を開始する前にすべてのソリューションを冷やします。静かに、手動で大規模なbに各カエルの卵を排出する1X MMRを含むeakers。各コンテナから卵を選別し、手順から斑点、溶解またはアクティベーション（動物半球の色素沈着の収縮により可視化）の兆候と卵の任意のバッチを省略する。さらに色素沈着で切れ目のない卵を集める。良い卵は、カエルのバケットで1X MMRから収集することができます。卵の合計量は8-12人の女性から&gt; 100mLのはずです。 </li><li>脱ゼリー卵。これを行うには、できるだけ多くのMMRを削除するシステイン溶液の少量を追加し、渦巻き卵を。新鮮なシステイン溶液で脱jellying中に数回交換してください。脱ゼリーを別々の卵の各バッチと破損や卵の活性化でバッチを捨てる。卵の残りの部分を組み合わせる。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤で卵の抽出バッファー（XB）の〜35 mLの4回、及びその後CSF - XBを25mLの2回洗浄する。 </li><li>卵をパックする：ベックマンultraclear管に卵を移す。卵が沈殿することができます。できるだけCSF - XB限りを削除します。 4℃〜60秒を1000rpm（150グラム）で、ベックマンSW 40 Tiローターを（または類似のローター）を使用して卵を遠心℃にパック卵の上から余分な溶液を除去。 </li><li> 4℃で10分間10,000 rpmで（16,000 g）で卵を遠心℃に：卵をつぶすと、細胞質抽出物を生成するには脂質（上部）、細胞質（中央）、及び卵黄（底部）：卵は3つのレイヤーに分離する必要があります。細胞質層の基部にチューブを通して針を挿入することによって18ゲージ針で各試験管から細胞質層を収集する。氷の上に新鮮なultraclearベックマンチューブに細胞質を移す。 </li><li> 1Xの最終濃度に分離された細胞質に、プロテアーゼ阻害剤を追加。 4℃で10分間16,000 gで細胞質をRecentrifuge℃に前述のように明確に細胞質を収集する。 0.75から1 mLの細胞質/カエルを得ることを期待。 </li><li>サンプルへのエネルギーミックスの抽出量の1 / 20を追加。ベックマンTL - 100超遠心機用厚肉ポリカーボネートチューブに細胞質を移す。チューブは、3 mLのそれぞれについて保持と完全な少なくとも半分にする必要があります。 </li><li> 0.4mMの最終濃度を各チューブに1 M CaCl 2を追加。室温で15分間チューブをインキュベートします。これにより、CSFを不活性化し、相間にエキスをプッシュします。 </li><li>チューブのバランスをとり、4℃で1.5時間70,000 rpmで（200,000 g）でTLA - 100.3ローター℃を用いてベックマンTL - 100超遠心機でそれらを遠心細胞質は上から下へ、4つの層に分画するなります：脂質、細胞質、細胞膜/ミトコンドリア、及びグリコーゲン/リボソーム。 </li><li>脂質層を介してチューブの上部に注射器を挿入して、各チューブ（〜1 mLを2〜3 mLを試験管にロードされている場合）から細胞質層を削除します。新鮮なチューブに細胞質画分を移し、4℃で20分間70,000 rpmで（200,000 g）を℃でサンプルをrecentrifuge </li><li> 0.5 mLチューブに25μlを上清に分注し。使用するまで-80℃で液体窒素や店舗° Cのアリコートを急速凍結。エキスが有効であるかどうかを判断するには、精子核は抽出液中にインキュベートし、核が目に見えて、室温で加え、10分以内に（厚くし、長く）膨潤かどうかを判断するためにヘキストで染色することができます。 </li></ol> C.のトランスジェネシスの反応と核移植重要：ソリューション、機器やカエルが反応を開始する前にすべての準備ができていることを確認してください。多くのコンポーネントが&gt; 30分間安定した状態を維持しないので、いったん作業を開始するには、以下に説明するおおよその時刻表を使用して反応を進める必要があります。精子核の在庫は氷上で保持されていますが、形質転換反応（希釈と濃縮された両方）を室温で維持する必要があります。 <ol><li>首相女性カエル。遺伝子導入前の夜、翌日から始まる新鮮な卵を得るために背側リンパ嚢におけるHCG 800台で、いくつかの（3-5）成人女性のカエルを注入する。 </li><li>形質転換の手順の一日、遺伝子導入に必要なソリューションを準備したり、温度にもたらす。 <ol class="lalpha"><li>焼きたてのシステイン（1XMMR、pH8.0で2.5％）。あなたがその日に使用されるいくつかの百ミリリットルが必要になります。 </li><li>移植の料理と胚を上げるためのトランスジェニック胚と0.2XMMR 100μg/ mLのゲンタマイシン（フィコールなし）の回復のための0.2XMMR +6％フィコール。ソリューションは、° C、高温以来悪影響を遺伝子導入し、胚発生の両方の周波数に影響を与える° Cとトランスジェニック胚を16と21との間の温度で早期に開裂によって発生させる必要がある18から21よりも暖かくてはいけません。 </li><li>解凍し、その日の移植のためにSDBの室温冷凍アリコート（精子の希釈バッファー）に平衡化し、氷上での高速抽出と場所を解凍し、100mMのMgCl 2溶液を準備する。 </li><li>目を得る電子アガロースインジェクション料理とMMR /フィコール液で塗りつぶし、および設定し、流れを安定させるために輸液ポンプを事前に実行してください。 </li><li>女性のカエルが産卵していると卵が高品質であることを確認してください。最適に、卵はしっかりと皮質を（デjellying後の形状を保持する）必要があります。 </li></ol></li><li>遺伝子組み換えの反応を設定します。 <ol class="lalpha"><li>非常に穏やかに（クリッピングピペットチップを使用して）核の株式を混在させると1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに結合する： 4μl原子核（〜4 - 8X10 5核） 2μlのは、直鎖化されたプラスミド（100ng/μl） 室温で5分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーションが進行している間に、4.5μlH 2 Oで制限酵素の0.5μlを希釈し、SDBの18μl、MgCl 2を2μlのと、高速抽出の2μlのために希釈した酵素1μlを加える。核-プラスミド反応するために、この混合物を追加。核の膨潤に10分以上インキュベートする。 </li><li>このインキュベーションの間に、システイン溶液で2-3カエルの卵と脱ゼリーを絞る。 1XMMRで（5倍）だけでなく、それらを洗浄し、0.2 × MMR +4％フィコールを含む各アガロースウェルディッシュに400から500 dejellied卵を転送するために広いボアピペットを使用してください。卵料理は、反応は通常希釈する準備ができて準備されればこれは通常ので、約10分かかります。 </li><li>約15〜20分のステップを開始した後、静かに切り取られた先端との反応（核/抽出/ DNA）を混合し、室温で150〜5μlの約200μlSDBを追加。濃縮された混合物に残っているときに限り、移植の容量を保持していないのに対し、この希釈混合物中の核は、1時間程度。ために安定しています。 </li></ol></li><li>針を読み込む：広いオリフィスのピペットチップを使用して非常に穏やかに上記で調製した希釈した反応を混ぜ合わせ、その後、核がチューブから急速に定着するので、速やかに針をロードする。荷物を積み込む針に、クリップされた200μlのピペットチップの先端に細かいタイゴンチューブを置きます。ピペットの先端にソリューションを引き、その後針にチューブを接続し、解決策が重力により針を入力またはピペットのプランジャーを押し下げることができます。 </li><li>チューブをポンプし、核の移植を開始するために針を取り付けます。注射はダメージを与えることを避けるために、迅速な浅いとほぼ垂直に卵の細胞膜にしてください。フロー推奨さ（10nl/sec）の割合で、〜0.5秒のための卵に針を保つ。あなたは、20〜30分以内に移植の1〜2皿を完了する必要があります。 </li></ol>胚が4から8細胞期に達するまでの注射の後、16-20℃で料理を残す。 0.2XMMR +4％フィコールの新鮮な大きな皿に（先端のガラスパスツールピペットの卵とほぼ同じ直径）転送することにより、離れて自分の非切断隣人から切断胚を並べ替えます。少人数のグループ（/ウェル、6ウェルプレートの10〜15胚）と0.2XMMRの文化（無フィコール）初期の開発を通じて、100μg/ mlのゲンタマイシンに切断胚を分割します。どんな死に胚が速やかに除去し、メディアが必要に応じて変更して胚は原腸陥入時にチェックする必要があります。 トラブルシューティング： <ol><li>針がブロックされています：針からの溶液の流れは、移植時に明らかなはずである。針が目に見える粒子状物質によってブロックになった場合は、針を変更したり、鉗子で先端をクリッピングし、針を介して解決策を押すことにより破片を除去してみてください。 </li><li>いいえ切断卵が得れていない：精子の核と注入量の希釈液が適切であることと、針が移植中にブロックされていないことを確認してください。注入量が多すぎると、卵はまた、代わりに切断するとは変色した色素沈着やダメージが表示されない場合があります。 </li><li>多くの胚は原腸形成中に死亡する。いくつかの要因は、胚の生存率を高めることができる。 <ol><li>準備中の原子核と酵素反応に注意してください。脱凝縮した核は壊れやすく、上記の時刻表を使用して移植する必要があります。氷の上に置かないでください。 </li><li>酵素反応と核移植の間に精子の核によって支え染色体損傷は、形質転換の頻度と胚の正常な発展の両方に影響を与えます。核への染色体損傷は、形質転換の効率を高めるがマイナスの生存/正常な発達に影響を与えます。減少または酵素のインキュベーションの間に制限酵素を省略すると、通常の開発の速度を向上させることができますが、トランスジェネシスまたは胚のゲノムに導入したプラスミドコピー数の頻度を低下することがあります。 </li><li>後期原腸胚を通じて胞胚は、変色や細胞死の兆候を示す場合には、移植に用いられる試薬は、卵に有毒であることも可能です。加えて、卵ならsが会社の皮質を持っていない、彼らはexogastrulationを受けると、通常のポスト原腸胚の生成に失敗することがあります。 </li></ol></li><li>導入遺伝子を発現する胚の数は低いです。制限酵素の量を増やします。 </li></ol>代表的なトランスジェニック胚結果<img src="/files/ftp_upload/2010/2010fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 興味のあるプロモーターからの発現が表示されるまで、核の移転から得られたトランスジェニック胚を送出しなければなりません。上記の図1では、筋アクチンプロモーターは、このトランスジェニックオタマジャクシの体節に緑色蛍光タンパク質の発現を駆動する。

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</ol>

動物実験は医学のワシントン大学で動物実験委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

各トランスジェニックコンストラクトがテストするために、我々は一般的に500から1000の卵に細胞核を移植し、このスケールで、我々は、産卵のた​​めに誘導する方法多くの女性に応じて、一日あたり10種類の構成要素にまで発現するトランスジェニック胚を生成することができます。これらの移植のうち、卵を切断の約3分の1と、これらの切断胚の60〜80％は、通常、原腸形成を進めます。これらの胚の10〜50％の間、使用される反応条件に応じて興味のある遺伝子を発現する。この手順は、研究室で確立されると、そのため、、それは一日の異なるプラスミドの数を発現するトランスジェニック胚の個体群を作成する1つのワーカーが可能です。導入遺伝子はコンカテマー（5〜35枚）などのゲノムに組み込まれているため、このメソッドはまた、高い周波数で単一胚（80〜90％）4のゲノム中に複数の異なる導入遺伝子を共挿入するために使用することができます。 ここで説明するトランスジェネシスの手法は成功し、関心のある遺伝子をmisexpressする遺伝子調節を研究するため、および目的の細胞や構造のマーカー/蛍光レポー...

A.精子核の準備試薬： <ol><li> 1X MMR（2mMのCaCl 2を 、5mMのHEPES、pH7.5、2mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2を 、100mMの塩化ナトリウム）。 </li><li> 0.1パーセントTricaineメタンスルホン（MS222、アミノ安息香酸エチルエステル、シグマA - 5040）、0.1％重炭酸ナトリウム。水に溶ける。 </li><li> 2X核準備バター（NPB）。 pHが7.7になるようにKOHで滴定、500 mMスクロース（1.5 M株）、30mMのHEPES（1M株式：精子核の準備の日に、凍結保存されたストック溶液のアリコートから2X NPB 30mlを作る15mMの）、1 mMのスペルミジン塩酸塩（シグマS - 2501、10 mMストック）、0.4mMのスペルミン四塩酸塩（シグマS - 1141、10 mMストック）、2mMジチオスレイトール（シグマD - 0632、100 mMストック）、2mMのEDTA（500mMのEDTA、pH8.0）に。 </li><li> aを作るために2XNPBを使用して、 30ミリリットル1X NPB、B. 10ミリリットル1XNPB 3パーセントBSA（フラクションV、シグマ- 7906）、C. 5ミリリットル1XNPB 0.3パーセントのBSA。 </li><li>リゾレシチン：10 mg / mlのL -α-リゾレシチン、卵黄（カルビオケム、440154）の100μlのは、使用直前に室温で溶解する。 20店舗固体株式℃にそれが粘着性になった場合株式の粉を捨てる。 </li><li>ウシ血清アルブミン（BSA）：10％（w / v）のBSA（フラクションVは、シグマA - 7906）精子核の準備の日に水に5 mlをメイク。 </li><li>精子貯蔵緩衝液（1ミリリットル）1X NPB、30％グリセロール、0.3％BSA。 </li><li>精子の希釈緩衝液：250mMスクロース、75mMの塩化カリウム、0.5 mMのスペルミジン塩酸塩、0.2mMのスペルミン四塩酸塩。 pHが7.3から7.5と20店舗0.5〜1ミリリットルのアリコートに滴定℃に</li><li>ヘキスト番号33342（シグマB - 2261）：のdH 2 Oで10 mg / mlストック、20℃での光タイトな容器に保管℃に</li></ol>設備： <ul><li>スイングロータと遠心機</li><li>チーズクロス</li><li>解剖ツール（鉗子や鋏） </li><li>蛍光顕微鏡</li><li>漏斗</li><li>手袋</li><li>血球計</li><li>針（26ゲージ） </li><li>ペーパータオル</li><li>シャーレ（60 mm）の</li><li>ピペット</li><li>プラスチック（5および10 ml） </li><li> Pipetmanのヒント（1 mlおよび200μlの） </li><li>シリンジ（1ml）を</li><li>チューブ（14ミリリットル、ファルコン、2059） </li><li>チューブ</li><li>マイクロ遠心機（1.5 ml）を</li></ul>高速抽出のB.の準備試薬： <ol><li> 1X Marcの修正リンガー（MMR）：100mMのNaCl、2mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2を 、5mMのHEPES、pH7.5の。 10Xの在庫を準備し、そしてNaOHでpHを7.5に調整する。 </li><li> 20倍の抽出バッファー（XB）塩の株式：2 M KClを、20 mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2で 、4でろ過滅菌し、℃で保存</li><li> 1X XB塩、50 mMスクロース、10mMのHEPES緩衝（1Mストック、15 mMに希釈したときのpHは7.7であるので、KOHで滴定する。フィルター滅菌し、アリコートの店：、バッファを（新しく調製し、氷上で保存されているXB）抽出20℃）。 100ミリリットル程度の準備。 </li><li> 2％（w / v）のL -システイン塩酸塩1水和物：使用前に1X XB塩で60,600とNaOHでpH 7.8に滴定。 300ミリリットル程度の準備。 </li><li> CSF - XB：1X XB塩、1mMのMgCl 2（XB塩の2に存在して塩化マグネシウムに加え、最終濃度2 mM）を、10mMのHEPES、pH7.7の50 mMスクロース、5mMのEGTA、pHは7.7。 50mlを準備する。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤：ロイペプチンの混合物、キモスタチン、及びペプスタチン、ジメチルスルホキシド（DMSO）に10 mg / mlの最終濃度に溶解して各。 20小アリコートで℃で保存</li><li> 1 M CaCl 2を 。 </li><li>エネルギーミックス：150mMのクレアチンリン酸、20mMのATP、20mMのMgCl 2の 。 </li><li>妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）：100 U / mlのPMSG（PG600 ®、インター社、021825）。水に溶かし、20℃で保存</li><li>ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）：1000 U / mlのHCG（CHORULON ®、インター社、057176）。水に溶解し、4℃で保存</li></ol>設備： <ul><li> アフリカツメガエルの雌</li><li>針（18および26ゲージ） </li><li>パスツールピペット</li><li>ワイドボア</li><li>シリンジ（1 mL）を</li><li>チューブ、マイクロ遠心機（0.5 mL）を</li><li>チューブ、肉厚ポリカーボネート（ベックマン、349622） </li><li>チューブ、ultraclear（14 × 95ミリメートル、ベックマン、344060） </li><li>超遠心機とローター（例えば、ローターSW 40 TiおよびTLA - 100.3とベックマンTL - 100） </li><li>採卵用ビーカー</li><li>女性のカエルを保持するためのバケットまたは容器（例えば、メッシュの蓋付きの4 Lプラスチックビーカー）。 </li></ul> C.核移植。 試薬： <ol><li> 0.1XMMRでは2.5％アガロース（インジェクションの料理を作るための） </li><li> 1XMMRで2.5％システイン、pH8.0、使用当日に準備</li><li>フィコール</li><li> 10 mg / mlのゲンタマイシン（1000X株） </li><li>高速の卵抽出液（上記参照） </li><li> 100 MgCl 2の </li><li> 10X MMR（上記参照） </li><li>制限酵素（New England Biolabs社から例をNotI） </li><li>精子の希釈バッファー（SDB;上記参照）と精子の核（上記参照） </li><li>ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）上記のような</li><li>ミネラルオイル（Sigma社、M8410） </li><li>導入遺伝子として導入される線状化プラスミド：無菌で約100 ng /μLのヌクレアーゼフリー水（我々はトリスとEDTA含有胚に多少有毒であるバッファを、避ける）の濃度で線状化プラスミドの準備。プラスミドを線形化するために使用する制限酵素は、核移植の反応で使用されるものと同じである必要はありません。我々は通常、関係なくて直線化されたプラスミド何の、すべての反応にNotI部位を使用してください。あまりにも多くの酵素は、後の原腸胚の発達に有害影響を引き起こす可能性があるとして反応に用いる酵素の希釈のいくつかのキャリブレーションは、必要な場合があります。プラスミドは、いくつかの異なる方法で精製することができます：我々は通常、メーカーの指示に従ってキアゲンQIAクイックPCR精製キットを使用して、ゲルからの単一バンドの精製は必要ありません。プラスミドをフェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を用いて精製されている場合は、有機物とエタノールの痕跡をすべて削除するようにしてください。 </li></ol>設備： 注射用アガロース料理：60ミリメートルのプラスチックペトリ皿の中では、小さな35mmX35mmが卵を埋めるためのアガロースでコーティングされた底面でうつ病を作成するには、水の0.1XMMRで溶融2.5％アガロースでボートの重量を量る置く。後は4℃でアガロースが硬化している、パラフィルムでラップして保管·使用するまで、C。あなたがする予定の各トランスジェニック反応のため、事前に2〜3皿を作る。 注入ポンプ：私たちは、ミネラルオイルで満たされた3 ccシリンジ/ニードル（シグマM - 8410）を搭載したハーバード装置、から単一のシリンジ注入ポンプを使用する。注射針の先端を（チューブを穿孔からそれを維持するために）鈍らせると細かいタイゴンチューブを取り付けます。 〜10nl/secでポンプを実行して、これは針がそれぞれの卵になっている時間は秒1より大きくなることはなることを想定しています。ポンプは、シリンジ用プランジャーは、ピストンとチューブの外油のその着実な正の流れが発生しているとぴったり重なることを保証するために前日の出発遺伝子導入へ数分のために事前に実行する必要があります。 核移転の​​ための針。マイクロピペットプラーを使用して、長く、傾斜​​した先端を持つ針を生成します。斜めの形状で〜80ミクロンの開口部を得るために接眼マイクロメータを装備した解剖顕微鏡下forcepでこれらのクリップ。 他の機器： アフリカツメガエルの女性、実体顕微鏡、インキュベーター、マイクロマニピュレータ、マイクロインジェクションニードルプラー（例：モデルP - 87、サッタ）、注射針（26ゲージ）、ガラスのマイクロインジェクションの針、80μmの直径へのマイクロインジェクションの針先のキャリブレーションクリッピングのための接眼マイクロメーター、ペトリ皿は、ボート35ミリメートル、タイゴンチューブを（ID = 1 / 32インチ、OD = 3 / 32インチ）重量

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

アフリカツメガエルのゲノム中にクローニングされた遺伝子産物の安定的な統合は、胚発生の後期段階で遺伝子を発現すること、およびエンハンサーおよびプロモーターは、胚内で遺伝子発現を調節する方法を定義するために、式の時間と場所を制御する必要がある。ここに示したプロトコルを効率的にトランスジェニックアフリカツメガエルの胚を生産するために使用することができます。 1：このトランスジェネシスの手法は、三つの部分を含む。精子の核は、成人Xから分離されています精子形質膜をpermeabilizesリゾレシチンで処理してツメガエル精巣、。 2。卵抽出液を低速遠心分離、抽出物は細胞周期の間期へと進行させるためにカルシウムを加え、そして相間の細胞質を分離するため、高速遠心分離によって調製される。 3。核移植：核とエキスは、導入遺伝子及び制限酵素を少量として導入される直鎖状プラスミドDNAと結合されています。短い反応中に、卵抽出物は部分的に精子クロマチンをdecondensesと制限酵素は、ゲノムへの導入遺伝子の組換えを促進する染色体切断を生成します。処理された精子の核は、未受精卵に移植されています。導入遺伝子の統合は、通常、結果として得られる胚のキメラではないというような最初の胚の切断の前に発生します。これらの胚は、プロモーターと遺伝子機能の解析のためのトランスジェニック胚の効率的かつ迅速な世代を可能にする、次の世代に繁殖することを必要とせずに解析することができます。成人X.この手順に起因するツメガエルはまた生殖細胞を通じて導入遺伝子を伝播し、複数の目的のためのトランスジェニック動物の行を生成するために使用することができます。

このビデオプロトコルは、トランスジェニックを生成する方法を示しています<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;未受精卵に核移植に続いて精子の核への導入遺伝子の導入による。

クローン化した遺伝子産物をXenopusゲノムに安定的に組み込むことは、発現の時間的・空間的な制御や、胚発生の後期段階における遺伝子発現、さらにエンハンサーおよびプロモーターが胚内でどのように遺伝子発現を調節しているかを明らかにすることを可能にするために不可欠である。本プロトコルで実演する手法を用いることで、トランスジェニックなXenopus laevis胚を効率的に作製できる。このトランスジェネシスアプローチは、以下の3つの工程からなる。1. リゾレシチン処理によって精子の細胞膜を透過性にし、成体X. laevisの精巣から精子核を単離する。2. 低速遠心分離を行い、カルシウムを添加して抽出物を細胞周期の間期まで進行させ、さらに高速遠心分離を行うことで間期細胞質を単離し、卵抽出液を調製する。3. 核移植：単離した核と抽出液を、トランスジーンとして導入する線状プラスミドDNAおよび少量の制限酵素と混合する。短時間の反応により、卵抽出液が精子クロマチンを部分的に脱凝縮させ、制限酵素が染色体断片を生成することで、トランスジーンのゲノムへの組み込み（組み換え）が促進される。処理した精子核を未受精卵に移植する。トランスジーンの組み込みは通常、胚の初回卵割前に起こるため、得られる胚はキメラにならない。これらの胚は次世代へ交配させる必要なく解析可能であるため、プロモーターおよび遺伝子機能の解析に向けたトランスジェニック胚を効率的かつ迅速に作製できる。本手法により得られた成体X. laevisは、生殖細胞系列を通じてトランスジーンを伝播させることができ、多目的なトランスジェニック動物系統の構築に利用可能である。

Xenopusの胚発生における遺伝子発現を研究するには、クローン化された遺伝子産物をゲノムに安定的に組み込む必要があります。まず、成体カエルの精巣から精子核を単離し、透過処理を行います。次に、Xenopusの卵から間期細胞質抽出液を調製します。精子核と卵抽出物を、線状化したトランスジェニックDNAおよび制限酵素と混合します。このステップにおいて、卵抽出物が精子クロマチンを脱凝縮させ、同時に制限酵素がトランスジェンの統合を促進します。最後に、処理した核を未受精卵に導入します。得られた胚の各細胞がトランスジェンを保持しており、プロモーター依存的なトランスジェンの発現は、免疫蛍光顕微鏡法またはその他の手法で検出されます。DNA注入などの他の手法に対する本法の主な利点は、得られた胚が最初の卵割前にトランスジェンの組み込みを行う点にあります。これにより、得られた胚はキメラにならず、交配を行う必要がありません。本プロトコルを用いることで、わずか数時間で大量のトランスジェニック胚を迅速かつ効率的に作成できます。これらのトランスジェニック胚は、プロモーターや遺伝子の機能解析に使用できるほか、交配させてトランスジェニック系統を作成させることも可能です。この手順の最初のステップとして、安楽死させた1〜2匹のカエルの精巣を、乾いた60 mmペトリ皿に移します。ピンセットを用いて、塊が見えなくなるまで精巣をすり潰してください。冷やした核調製バッファー（NPB）2 mLをすり潰した組織に加え、ピぺッティングで穏やかに混ぜ合わせ、チーズクロス約4枚分を重ねたフィルターを通して漏斗に注ぎ、ろ液を15 mLチューブに回収します。次に、シャーレを8 mLのNPBで洗浄し、チーズクロスを通してチューブにろ過します。この溶液には、手袋を着用した状態で回収した精子が含まれています。チーズクロスを絞って残りの液体を回収し、4°Cで10分間遠心分離して精子をペレット化します。遠心分離後、上清をデカントします。次に、8 mLのNPBを加え、ピペッティングしてペレットを再懸濁させます。再度スピンダウンさせ、その間に1 mLのNPBを室温まで戻しておきます。遠心分離後、ペレットを1 mLのNPBに再懸濁し、10 mg/mLの新鮮に調製したlysolecithinを50 µL添加して精子を透過させます。この精子混合液を室温で5分間静かにインキュベートします。次に、3% BSAを含む冷やした1X MPBを10 mL、チューブに加えます。ライセチン反応を停止させるため、処理したライセチンをスピンダウンします。ペレットは、処理前よりもわずかに透明に見えるはずです。ペレットを0.3%BSAを含む冷NPB 5 mLに再懸濁して精子核を洗浄し、10 mLピペットで穏やかに混ぜ合わせた後、遠心分離します。遠心後、上清をデカントしてペレットを再懸濁します。精子保存バッファー500 µL中で精子を1.5 mLチューブに移します。これが核ストックとなります。このチューブを氷上に置き、核の回収量を確認してください。1.5 mLマイクロ遠心チューブに、98 µLの精子希釈バッファー、1 µLの核ストック、および1/100に希釈したhuxストック1 µLを入れます。よく混ぜ合わせます。ピペットマンを使用して、少量を毛細管現象によりヘモサイトメーターのチャンバー内に流し込みます。複合顕微鏡下で核の数を数えます。雄1匹あたり5,000万〜1億個の細胞が得られるはずです。凍結保存の質を高めるため、グリセロールを浸透させる目的で核を4°Cで一晩置きます。液体窒素で凍結した分注試料は－80°Cで保存します。8～12匹の雌から採取した卵をビーカーに移し、約35 mLの抽出バッファーで4回洗浄し、その後、プロテアーゼ阻害剤を含む細胞質静止因子抽出バッファー（C-S-F-X-B）25 mLで2回洗浄します。卵をパックするため、Beckman UltraClearチューブに移し、卵を沈殿させます。C-S-F-X-Bを可能な限り除去し、150 Gsで約60秒間遠心分離します。遠心分離後、凝集した卵の上部にある余剰な溶液を除去します。次に、卵を破砕して細胞質抽出液を作成するため、4°Cで16,000 Gsで10分間遠心分離します。これにより、卵は3層に分離されます。最上層は脂質、中間層は細胞質、そして最下層は卵黄で構成されています。18ゲージの針をシリンジに装着し、中間層の底部にあるチューブを通して挿入し、細胞質溶液を吸引します。溶液を氷上の新しいUltraClear Beckmanチューブに移します。単離した細胞質にプロテアーゼ阻害剤を加え、最終濃度を1xにします。この細胞質調製液を16,000 Gで10分間遠心分離します。4 °Cで、清澄化した細胞質を新しいチューブに移します。1匹のカエルあたり0.75から1 mLの細胞質が得られる見込みです。次に、抽出液量の20分の1量のエネルギーミックスをサンプルに加えます。細胞質を厚壁ポリカーボネートチューブに移します。超遠心分離のため、各チューブに最終濃度が0.4 mMとなるように1 Mの塩化カルシウムを加えます。チューブを室温で15分間インキュベートします。これにより、細胞質静止因子（CSF）が不活化され、抽出物が間期へと移行します。その後、遠心分離を行います。超遠心機を用いて4°Cで200,000 Gsで1.5時間遠心分離すると、細胞質は上から順に、脂質層、細胞質溶質（サイトソル）層、膜分画層、およびミトコンドリア・グリコーゲン・リボソーム層の4つの層に分離されます。チューブの上部にシリンジを挿入し、サイトソル層を回収してください。これは約1 mLになるはずです。チューブに2〜3 mLがロードされていた場合は、細胞質画分を新しいチューブに移し、サンプルを4 °Cで20分間、200,000 Gsで遠心分離し、上澄みを0.5 mLチューブに25 µLずつ分注してください。分注したサンプルを液体窒素で急速凍結し、使用時まで-80 °Cで保存します。トランスジェネシス反応を準備するには、カットしたピペットチップを使用して核ストックを静かに混ぜ、1.5 milliliterのマイクロチューブに4 µLの核と2 µLの線状化プラスミドを合わせます。室温で5分間インキュベートします。インキュベートしている間に、0.5 µLの制限酵素を4.5 µLの水で希釈します。次に、希釈した酵素1 µLを、精子希釈バッファー18 µL、塩化マグネシウム2 µL、および高速遠心抽出液2 µLに加えます。この混合液を核・プラスミド反応液に加えます。このインキュベーション中に核を膨潤させるため、さらに10分間インキュベートします。2〜3匹の雌ガエルから得られた卵を脱卵し、1X MMRで5回洗浄します。太いボーアピペットを用いて、脱卵した卵400〜500個を、0.2X MMRと4%フィコールを含むアガロースウェルディッシュにそれぞれ移します。トランスジェネシス反応の開始から約15〜20分後に呼び出します。ECクリップチップを用いて、核、抽出液、DNA反応液を静かに混合し、反応液5 µLを室温で150 µLの精子希釈バッファーに加え、ニードルにバックロードします。ECクリップ200 µLピペットチップの先端に、細いTIGチューブを装着します。溶液を吸い上げます。次に、チューブを針に接続し、重力によって溶液が針の中に入るようにします。針をポンプチューブに接続します。卵を顕微鏡ステージの上に置きます。次に、1つ目の卵に針を速やかに刺入します。注入は浅く、X細胞膜に対してほぼ垂直に行う必要があります。損傷を避けるため、針を卵内に約0.5秒間保持します。毎秒約20 nanolitersの速度で注入することで、1〜2皿分の移植を20〜30分以内に完了させることができます。注入後、胚が4〜8細胞期に達するまで、皿を16〜20 degrees Celsiusで保持してください。核移植によって得られた形質転換胚は、ここに示す画像のように、目的のプロモーターからの発現が確認できるまで育成してください。この形質転換オタマジャクシでは、筋肉アクチンプロモーターが体節における緑色蛍光タンパク質の発現を誘導しています。このビデオを視聴することで、精子核の核移植を用いて形質転換Xenopus胚を作製する方法について、十分に理解できるはずです。この手法はXenopus laevisを用いたトランスジェネシスで実証されていますが、わずかな修正を加えることでXenopus tropicalisにも適応させることができます。

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

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