ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)の定量化:シナプスの形態と機能を評価する方法

- まず、ショウジョウバエの幼虫を、NMJまたは神経筋接合部のさまざまな側面を強調するマーカーで免疫染色します。これは、運動ニューロンの軸索の終末が筋肉に接触する領域であり、その形態はシナプス機能の読み出しとして使用されます。

軸索は、ブートンと呼ばれる膨らみを形成するいくつかの枝で終わります。神経伝達物質はブートンから放出され、筋肉の収縮を引き起こします。神経伝達物質が放出される領域は、アクティブゾーンと呼ばれます。ここで、1つのマーカーはNMJの輪郭を描くシナプスタンパク質に特異的であり、もう1つのマーカーは活性ゾーンに存在するタンパク質に特異的です。

次に、顕微鏡を用いてNMJ画像を取得し、半自動画像解析ソフトウェアを用いてその形態を定量的に評価します。プリセットの一連のソフトウェアコマンドを画像に適用します。出力ファイルには、解析されたNMJ画像と形態結果が含まれています。測定可能な特徴には、ブートンの数と表面積、NMJの長さと分岐数、接続されていないNMJコンパートメントの数、およびアクティブゾーンの数が含まれます。

以下の例では、シナプス後マーカーであるDLG1と活性ゾーンマーカーであるBRPで染色したショウジョウバエのNMJの形態を解析します。

- このプロトコルでは、NMJの画像スタックを生成し、チャンネル1がDLG1染色または類似のマーカーを示し、チャンネル2がBRP染色を示す個別のTIFFファイルとして保存します。まず、NMJ 画像ファイルの Z 投影法とハイパースタックを作成します。プラグインオプションを開き、ショウジョウバエNMJモルフォメトリクスを選択します。

次に、顕微鏡が画像シリーズをTIFFとして保存するときに画像シリーズに割り当てた一意のファイル文字列を特定します。これは画像名の末尾にあります。最も小さい平面とチャネル番号に指定された文字列をコピーして、一意のファイル文字列設定ウィンドウに貼り付けます。次に、サブマクロ「スタックに変換」を選択し、画像が配置されているディレクトリまたはフォルダを選択します。

イメージ ファイルごとに、デフォルト名 stack と flat stack という 2 つの新しいファイルが作成され、その後に元のイメージ名が続きます。その後、元のファイルを削除してストレージスペースを節約できます。次に、ショウジョウバエNMJモルフォメトリクスインターフェースから、定義されたROIサブマクロを選択し、画像ファイルディレクトリを選択します。

最初の投影が開いたら、フリーハンド選択ツールを選択し、マウスを使用して、対象のNMJ端子を含む領域を定義します。選択したら、定義されたターミナルウィンドウで[OK]をクリックします。すべての投影法で NMJ 端子が定義されるまで、この操作を続けます。マクロはプロセスを自動的に進行させます。イメージ ファイルごとに、デフォルト名 ROI の後に元のイメージ名が続く新しいファイルが 1 つ作成されます。

NMJの特徴を定量化するには、まずショウジョウバエのNMJ形態測定インターフェースに移動し、スケールを設定します。たとえば、画像の 1 ピクセルが 0.72 ミクロンに対応する場合は、スケール ピクセルを 1 に、スケール距離を 0.072 に設定します。次に、サブマクロの [分析] を選択し、チャネル イメージが 2 つある場合は、[待機] も切り替えます。[OK]を押し、プロンプトが表示されたら、イメージファイルディレクトリを選択します。処理時間は、シナプスあたり数分になる場合があります。

解析後、解析された各シナプスの新しい画像ファイルは親フォルダに保存され、定量的測定値はresults.txtファイルに保存されます。すべての画像を調べ、セグメンテーションエラーのある画像を除外します。

たとえば、シナプス末端の一部が黄色のアウトラインに含まれていない場合があります。背景の一部がシナプス終末に含まれる場合があります。青いスケルトンラインがシナプス末端を超えて伸びる場合があります。アクティブ ゾーンが多すぎるか、一部のアクティブ ゾーンが検出されないままになっている可能性があります。