2光子レーザーによる神経損傷:ショウジョウバエ幼虫の軸索変性と再生の観察法

- まず、清潔で麻酔をかけた幼虫をガラスカバースリップの下に頭を上にして取り付けます。次に、カバースリップをそっと押して幼虫を転がし、その位置を調整して、関心のある領域を露出させます。共焦点イメージングを使用して、幼虫の神経細胞を特定します。標的神経細胞の1つに特定の軸索を損傷部位として特定します。

次に、ターゲット軸索をイメージングに使用されるよりも高い出力で2光子レーザーにさらして損傷を誘発します。2光子レーザーは、周囲の組織への損傷を最小限に抑えながら、生体組織内の損傷を透過し、正確に局在化する能力があるため、使用されます。

標的ニューロンに損傷があり、軸索切開術または軸索の切断につながる場合は、すぐにレーザー照射を停止してください。最後に、損傷したニューロンを画像化して、目的の時点でのニューロンの変性とその後の再生を確認します。

プロトコルの例では、顕微鏡検査用の幼虫をマウントし、幼虫の感覚ニューロンに損傷を誘発し、神経再生を追跡します。

- 幼虫に麻酔をかけることから始めます。ドラフトに、60mmのガラス皿を15cmのプラスチック製のシャーレに入れます。次に、ティッシュペーパーを折りたたんでガラス皿に入れます。ジエチルエーテルを追加した後、ブドウ寒天プレートを組織の上に置きます。

次に、スライドガラスの上にハロカーボン27オイルを1滴中央に置き、四隅にそれぞれ真空グリースのスポットを置きます。次に、鉗子を使用して1匹の幼虫を寒天プレートに移し、ガラス皿を覆って幼虫に麻酔をかけます。溶岩の動きが止まったらすぐに、頭を直立させて慎重にハロカーボンオイルに移します。次に、スライドの上にカバースリップを置き、幼虫に触れるまでゆっくりと押し下げます。

次に、穏やかな力でカバースリップをスライドさせ、アブレーションする細胞を2光子レーザーが最も簡単に当たる場所に転がします。その位置は、どのニューロンが標的にされているかによって異なります。次に、アセンブリを2光子顕微鏡ステージに固定し、40倍油浸対物レンズを使用して目的の細胞に焦点を合わせます。

ソフトウェアで、スキャンモードに切り替えて、保存したプロトコルをロードします。ピンホールが完全に開いていることを確認してください。次に、ライブモードで、関心領域の適切な画像を取得します。

次に、ライブスキャンを停止して、切り抜きボタンが使用可能になるようにします。クロップ機能を使用して、スキャンウィンドウを調整し、ターゲット領域を負傷の見込み部位だけに焦点を合わせます。次に、新しいイメージングウィンドウを開きます。次に、スキャン速度を下げ、レーザー強度を上げます。次に、連続ボタンを切り替えてスキャンを開始および停止します。注意深く観察してください。蛍光が急激に増加したらすぐにスキャンを終了します。

次に、元のイメージングウィンドウに切り替えてライブモードを選択し、フォーカスを調整してターゲットにしたばかりの領域を見つけます。

- 怪我が成功したことを示す良い指標は、怪我の部位に小さなクレーター、リング状の構造、または局所的な破片が現れることです。レーザー出力が高すぎると、大きな損傷領域が見え、致命的となる可能性があります。

- 次に、カバースリップを慎重に取り外し、負傷した幼虫をイーストペーストで新しいプレートに移します。プレートをプロピオン酸に浸したティッシュと一緒に60ミリメートルの皿に入れます。その後、プレートを培養温度に戻します。

その後の幼虫のイメージングには、保存された共焦点セットアップを利用し、25倍の対物レンズでzスタック画像を収集します。再生を定量化できるように、正規化ポイントを必ず含めてください。