ゲノム修飾のスクリーニング:ショウジョウバエのCRISPR生成変異体を同定する方法

- 注入された胚がG0成体に成長したら、すべての個々のハエを適切なバランサーストックに交配して、潜在的なF1 CRISPR編集系統を拡大し、ゲノム修飾の遺伝を追跡できるようにします。次に、ランダムに選択されたF1シングルオスを適切なバランサーメスに交配して、F1オスが突然変異に陽性である場合に子孫を回復できるようにします。十字架が取られたら、F1オスをスクリーニング用のチューブに移します。

ゲノムDNAを抽出するには、抽出バッファーが入ったピペットチップでフライをつぶします。組織が分解されたら、液体を排出します。抽出バッファーには、サンプル中のタンパク質を消化し、高熱によって不活性化される酵素であるプロテイナーゼKが含まれています。

DNAにアクセスできるようになったので、PCRスクリーニングに進みます。たとえば、新しい配列を含む領域を増幅するように設計されたプライマーを使用します。修飾が存在する場合にのみ、2番目のプライマーが結合し、PCR産物が増幅されます。この例では、ハエを繁殖させ、分枝のない遺伝子の最初のエクソンを置き換えるトランス活性化配列を挿入するためにPCRによってスクリーニングします。

- 以前にガイドRNA発現プラスミドと置換ドナーの両方を注入したnos-Cas9胚が成体に成長すると、G0は個別にクロスフライして、標的対立遺伝子に適したラインからバランサーフライに飛びます。二酸化炭素パッド上の各G0クロスからF1の子孫に麻酔をかけ、実体顕微鏡で10〜20人のオスをランダムに選びます。選択した各雄を、標的対立遺伝子に適した線からバランサー雌に個別に交差させます。

F2の幼虫が孵化したら、各交配からF1の父親を選びます。50マイクロリットルのスクイッシングバッファーが入ったピペットチップで各フライを10〜15秒間スクイーッシングすることにより、バッファーを分注せずにゲノムDNAを抽出します。次に、残りのバッファーをチューブに分注し、よく混合します。

摂氏37度で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを摂氏95度のヒートブロックに1〜2分間置き、プロテイナーゼKを不活性化します。10,000 gで5分間スピンダウンした後、調製物を摂氏4度で保存し、さらなるPCR分析を行います。

プライマーフォワード1およびリバース1を使用して3ステップのPCRベースのスクリーニングを実施し、挿入または置換の存在をスクリーニングします。フォワード2プライマーおよびリバース2プライマーを使用してPCRを行い、3つのプライム領域からの挿入または置換を確認します。プライマーM13Fとリバース3を使用してPCRを行い、HDRのエンドインを確認します。

- フライラインは確認済みのエンドアウトHDRで保持し、F2世代からのバランスストックを確立します。バランサーは再び飛んで、他の染色体上の意図しない突然変異を取り除きます。