絨毛膜およびビテリン膜の機械的除去:ショウジョウバエ卵子を直接観察するための調製方法

- 生理食塩水中の固定卵巣からの成熟卵子から始めます。成熟した卵子は、外側の絨毛膜と内側のビテリン膜からなる卵殻を持っています。

絨毛膜とビテリン膜を機械的に除去するには、前処理した2つのスライドのつや消し部分の間に卵母細胞を置きます。上部のスライドをまっすぐ前後に動かして、卵子を転がす摩擦を作り出します。

次に、上部のスライドをわずかな角度で動かして、卵子を別の方向に転がします。円運動を避けて、上部のスライドが下部のスライドに対して垂直に移動するまで、この角度を少しずつ増やします。この動きにより、絨毛膜とビテリン膜が機械的に除去され、プローブや染色液へのアクセスが可能になります。

絨毛膜のない卵母細胞は長くて薄く見え、ビテリン膜のない卵母細胞は尖った端を持つことになります。透明化した卵子を周囲の破片から分離するには、サンプル混合物をチューブに移し、卵子が底に沈殿するのを待って、破片が上部に浮かんでいる間、除去することができます。

このプロトコルでは、成熟したショウジョウバエの卵母細胞から絨毛膜とビテリン膜を除去します。

- 後期卵子を分離するには、まず、浅い解剖皿にPBSBTx1ミリリットルを加えます。次に、先端がBSAコーティングされたP200を使用して、固定卵巣を浅い皿に移します。BSAコーティングされたピペットチップで卵巣を上下にピペットで動かし、成熟した卵子を成熟していない卵子から取り除きます。

後期卵子が十分に分離されたら、すべての組織を500マイクロリットルのマイクロチューブに移します。引っ張ったパスツールピペットで余分な液体を取り除き、チューブに約150〜200マイクロリットルを残します。

卵子のローリングに備えるには、200マイクロリットルのPBSBTxでディープウェルディッシュを事前に濡らします。

すりガラスのスライドを3つ用意し、スライドを3つ脇に置きます。次に、スライド1とスライド2のすりガラス領域をそっとこすります。脱イオン水ですすいでガラスの破片を取り除き、使い捨てワイプで乾かします。スライド1と2のつや消し領域をPBSBTxでコーティングするには、1つのスライドに50マイクロリットルのPBSBTxを追加し、この領域を他のスライドでこすります。使い捨てワイプで液体を取り除き、スライドを解剖顕微鏡の下に置きます。スライド 1 とスライド 2 のつや消し領域を、スライド 2 を支えるスライド 3 に接触させたままにします。

卵子を転がすには、まずP200ピペットチップをPBSBTxで事前に湿らせ、ピペッティングを上下させて卵子をマイクロチューブに分散させます。卵子を含む50マイクロリットルの液体をスライド1のすりガラス部分の中央に移します。これを行うには、スライド2を持ち上げます。

液体の表面張力が2つのすりガラス領域の間にシールを作成するまで、スラ