絨毛膜およびビテリン膜の機械的除去:ショウジョウバエ卵子を直接観察するための調製方法

- 生理食塩水中の固定卵巣からの成熟卵子から始めます。成熟した卵子は、外側の絨毛膜と内側のビテリン膜からなる卵殻を持っています。

絨毛膜とビテリン膜を機械的に除去するには、前処理した2つのスライドのつや消し部分の間に卵母細胞を置きます。上部のスライドをまっすぐ前後に動かして、卵子を転がす摩擦を作り出します。

次に、上部のスライドをわずかな角度で動かして、卵子を別の方向に転がします。円運動を避けて、上部のスライドが下部のスライドに対して垂直に移動するまで、この角度を少しずつ増やします。この動きにより、絨毛膜とビテリン膜が機械的に除去され、プローブや染色液へのアクセスが可能になります。

絨毛膜のない卵母細胞は長くて薄く見え、ビテリン膜のない卵母細胞は尖った端を持つことになります。透明化した卵子を周囲の破片から分離するには、サンプル混合物をチューブに移し、卵子が底に沈殿するのを待って、破片が上部に浮かんでいる間、除去することができます。

このプロトコルでは、成熟したショウジョウバエの卵母細胞から絨毛膜とビテリン膜を除去します。

- 後期卵子を分離するには、まず、浅い解剖皿にPBSBTx1ミリリットルを加えます。次に、先端がBSAコーティングされたP200を使用して、固定卵巣を浅い皿に移します。BSAコーティングされたピペットチップで卵巣を上下にピペットで動かし、成熟した卵子を成熟していない卵子から取り除きます。

後期卵子が十分に分離されたら、すべての組織を500マイクロリットルのマイクロチューブに移します。引っ張ったパスツールピペットで余分な液体を取り除き、チューブに約150〜200マイクロリットルを残します。

卵子のローリングに備えるには、200マイクロリットルのPBSBTxでディープウェルディッシュを事前に濡らします。

すりガラスのスライドを3つ用意し、スライドを3つ脇に置きます。次に、スライド1とスライド2のすりガラス領域をそっとこすります。脱イオン水ですすいでガラスの破片を取り除き、使い捨てワイプで乾かします。スライド1と2のつや消し領域をPBSBTxでコーティングするには、1つのスライドに50マイクロリットルのPBSBTxを追加し、この領域を他のスライドでこすります。使い捨てワイプで液体を取り除き、スライドを解剖顕微鏡の下に置きます。スライド 1 とスライド 2 のつや消し領域を、スライド 2 を支えるスライド 3 に接触させたままにします。

卵子を転がすには、まずP200ピペットチップをPBSBTxで事前に湿らせ、ピペッティングを上下させて卵子をマイクロチューブに分散させます。卵子を含む50マイクロリットルの液体をスライド1のすりガラス部分の中央に移します。これを行うには、スライド2を持ち上げます。

液体の表面張力が2つのすりガラス領域の間にシールを作成するまで、スライド2をゆっくりと下げます。つや消しの領域を覆うのに十分な液体があるはずですが、染み出しているものはあってはなりません。次に、片手で下部のスライドを1つ所定の位置に保持し、もう一方の手で上部のスライド2を水平方向に前後に動かし、スライド2を水平に保ち、スライド3で支えます。

顕微鏡下で行い、卵子の動きと進行状況を簡単に視覚化します。水平方向に数回移動した後、移動角度を少し変えます。複数の増分で、上部のスライド 2 の動きが開始方向に垂直になるまで、この角度を徐々に 90 度に増やします。空の絨毛膜が液体中に見え、絨毛膜が欠けている卵子はより長く、より薄く見えることに注意してください。

- 卵子を転がすときは、転がす方向が常に直線であり、決して円運動をしないようにしてください。

- 溶液がわずかに曇るまで、ローリングを約7〜10回繰り返します。卵母細胞の大部分がビテリン膜を失ったように見えるとき、転がるのをやめます。

上部のスライド2を静かに持ち上げ、その角の1つを下部のスライド1のつや消し領域の中心にドラッグして、転がされた卵子がつや消し領域の中心に蓄積するようにします。両方のスライドの卵子をPBSBTxで洗い流し、PBSBTxを含むディープウェルディッシュに入れます。

スライド1と2を超純水で洗浄します。使い捨てワイプで乾かし、リセットします。同じ遺伝子型のすべての卵子が転がされるまで、これらの手順を繰り返します。これには通常、遺伝子型ごとに3〜4ラウンドのローリングが必要です。

圧延後の破片を取り除くには、15ミリリットルの円錐管に1ミリリットルのPBSBTxを追加します。液体を渦巻いてチューブの側面をコーティングします。PBSBTxコーティングされたP1000ピペットチップを使用して、転がされた卵子をディープウェルディッシュから1 mLのPBSBTxが入ったコニカルチューブに移します。さらに2 mLのPBSBTxを卵子が入ったコニカルチューブに追加します。

円錐形のチューブを暗い背景に当てて、不透明な卵子が沈むのを確認します。卵子を底に沈殿させた後、P1000を使用して破片を含む溶液の上部2ミリリットルを取り除き、廃棄します。

この手順を合計 3 ラウンド繰り返して破片を除去した後、PBSBTx コーティングされた P1000 ピペットチップを使用して、卵子を元の 500 マイクロリットルのマイクロフュージチューブに戻します。20 〜 25 人の女性から約 50 マイクロリットルの丸まった成熟卵子が得られます。