ショウジョウバエ In Vivoカルシウムイメージング:神経活動の機能イメージング法
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- ショウジョウバエの神経系でin vivoカルシウムイメージングを行うには、GCaMPなどの遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターの発現を目的のニューロンに標的にします。ニューロンが活動電位を発火すると、膜の急速な脱分極により電位依存性カルシウムチャネルが開き、細胞外カルシウムが細胞内に流入します。
GCaMPは、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を修飾して、N末端のミオシン軽鎖のM13フラグメントとC末端のカルシウム結合タンパク質であるカルモジュリンに修飾融合した融合タンパク質です。カルシウムはカルモジュリンに結合し、GCaMPのコンフォメーション変化を引き起こし、タンパク質の蛍光を増加させます。
in vivoでの神経細胞活動の代理としてGCaMP蛍光の変化を画像化するには、予想される活動で神経系の領域を露出します。次に、GCaMPダイナミクスを捕捉でき、刺激送達セットアップを備えた蛍光顕微鏡を使用します。匂いなどの刺激を送達しながら、応答するニューロンのGCaMP蛍光を記録します。
このプロトコル例では、嗅覚連想学習中に脳のキノコ体内の反応を視覚化するためにGCaMP機能イメージングが使用されています。
- GFPベースのカルシウム指示薬の可視化には、赤外線レーザーと水浸対物レンズを備えた多光子顕微鏡のレーザーを防振テーブルに設置し、励起波長920ナノメートルに調整し、GFPバンドパスフィルターを取り付けます。粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンして、関心のある脳の領域を特定します。クロップ機能を使用して、スキャン時間を最小限にするために関心のある領域のみにスキャンを集中させ、頭の前方が下を向くようにスキャンビューを回転させます。次に、フレームサイズを512 x 512ピクセルに調整し、スキャンする領域を選択し、各フレームの計算されたスキャン時間を考慮して、少なくとも4ヘルツのフレームレートを実現します。
臭気誘発カルシウム過渡可視化のためには、画像取得ソフトウェアと臭気送達プログラムをリンクできる事前にプログラムされたマクロパッケージを開始し、顕微鏡ソフトウェアで6.25秒間測定を開始してF0ベースライン値を確立します。臭気供給システムでは、特定の臭気カップバルブの開閉をトリガーとして、ここではLEDの点灯で示される2.5秒の臭気刺激を送達し、続いて臭気オフセットの終了時に12.5秒の記録を行います。次に、同様に2番目と3番目の臭い物質の配信を繰り返します。
このセットアップで連想コンディショニングを実行するには、コンピューター制御の臭気配信システムを使用して、コンディショニングされた刺激と臭気を60秒間、12個の90ボルトの電気ショックとともに提示します。60秒の休憩後、電気ショックを与えずに60秒間、臭いを差し引いた状態を提示します。トレーニングフェーズの終了から3分後にトレーニング前の臭気刺激プロトコルを繰り返すことにより、トレーニング後に誘発される臭気誘発カルシウム過渡現象を再度測定します。次に、後で画像分析するために、イメージングファイルを適切な形式で保存します。
