線虫のナイルレッド染色:固定動物の脂肪滴を可視化する方法

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- 脂肪滴を可視化する場合、中性脂質の細胞内貯蔵オルガネラは、まずTriton X-100を含むような界面活性剤溶液をサンプルに加えることから始めます。これにより、ワームの細胞が透過します。次に、サンプルを適切な濃度のイソプロパノール(たとえば40%)に固定します。

次に、ナイルレッドをサンプルに加え、染料は光に弱いため、光から保護します。固定により、染料は動物全体の脂肪滴にアクセスできます。ナイルレッドは親油性色素で、その蛍光発光スペクトルは局所的な脂質環境の極性に依存します。

リン脂質などの極性脂質にさらされると、ナイルレッドの発光スペクトルはより高い赤色の波長になります。脂肪滴の中性コアにあるトリアシルグリセロールやステロールエステルなどの中性脂質にさらされると、ナイルレッドの発光スペクトルは低いイエローゴールドの波長にシフトします。

したがって、蛍光顕微鏡の緑色チャネルを使用して、イエローゴールドの波長発光を収集し、動物全体の脂質液滴のナイルレッド染色を視覚化します。プロトコルの例では、Nile Red染色手順と固定サンプル中の脂肪滴のイメージングを見ていきます。

- ナイルレッド脂質染色を行うには、線虫増殖培地(NGM)上のプレートワームに、後期ログOP50大腸菌を播種し、摂氏20度でワームを早期にL4ステージに成長させます。1ミリリットルのPBST溶液でワームを洗浄し、ワーム懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。

線虫を重力の560倍で1分間遠心分離し、上清を取り除き、大腸菌が懸濁液から除去されるまでPBST洗浄を繰り返します。次に、ワームペレットに100マイクロリットルの40%イソプロパノール(ORO染色の場合は60%)を加え、サンプルを室温で3分間インキュベートします。

- イソプロパノールの添加は、染色前の線虫の適切な透過処理に重要です。

- 重力560倍で1分間ワームを遠心分離し、ワームペレットを乱さずに上清を取り除きます。

- 遠心分離ステップ中の光への曝露を最小限に抑えることが重要です。

- 次に、暗闇の中で、事前に調製したNR作業溶液600マイクロリットルを各サンプルに加えます。チューブを3回反転させ、ウォームと溶液を完全に混合します。その後、サンプルを暗所で室温で2時間インキュベートします。

インキュベーション後、ワームを遠心分離し、上清を取り除きます。次に、600マイクロリットルのPBSTを加え、サンプルを暗所で30分間インキュベートして、余分なNR染色を取り除きます。前回と同様にサンプルを再度回転させた後、約50マイクロリットルの上清を除くすべての上清を取り除きます。

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最終更新:1 8月 2026