液体培養におけるRNAiフィーディング:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするためのハイスループット法

- まず、カルベニシリンと1ミリモルのIPTGを添加して、S基礎培地を含む培養フラスコを制御および試験します。成長段階1の幼虫(L1幼虫とも呼ばれる)の入ったチューブを数分間回転させます。次に、上清を取り除き、2マイクロリットルのL1を寒天プレートに置きます。プレートを解剖顕微鏡の下に置き、幼虫の数を数えます。

非特異的なRNAiプラスミドを保有するRNAi細菌をコントロールフラスコに、遺伝子標的RNAiを有する細菌を試験フラスコに添加します。追加される細菌の量は、ワームの数に比例する必要があります。

適切な酸素供給を確保するために、幼虫を絶えず振って成長させます。幼虫はバクテリアを食べます。幼虫の内部では、小さな干渉RNAが標的遺伝子によって生成された相補的なmRNAに結合し、タンパク質発現を阻害します。最後に、関心のある表現型についてワームを調べます。

プロトコル例では、液体培養で、daf-2遺伝子を標的とするRNAiでL1幼虫を治療します。

- 治療を開始するには、添付のテキストプロトコルに記載されているように、207.45ミリリットルのS基礎培地と追加の試薬を2,800ミリリットルのFernbach培養フラスコに加えます。カルベニシリン1ミリリットルあたり50マイクログラムとIPTG1ミリモルの最終濃度を加え、フラスコをメンブレンスクリューキャップで閉じます。

L1を摂氏25度のインキュベーターから取り出し、15ミリリットルのチューブに移します。L1sを1,900倍gで3分間遠心分離します。回転後、上澄み液を取り除きます。顕微鏡下で、2マイクロリットルあたりのL1を数え、少なくとも9滴から得られた数値を平均

次に、前のステップで準備した4つのFernbach培養フラスコに、若いワームコレクション用の50,000匹のワームと老化したワームコレクション用の100,000匹のワームを追加します。次に、線虫の数に比例して、コントロールRNAi細菌と目的の遺伝子のRNAi細菌を追加します。

バクテリアを追加した後、S基底で完全な線虫培養を行い、総容量を300ミリリットルにします。採取するまで、150 RPMの振とうインキュベーターで25°Cでワーム培養物をインキュベートします。