ショウジョウバエの生胚へのマイクロインジェクション:発生中の胚への試薬の早期送達

- 生きたショウジョウバエの胚を収集し、不透明な絨毛膜を取り除きます。次に、ガラスのカバースリップに、液体ヘプタンに溶解したテープ接着剤であるヘプタン接着剤のラインを塗布します。脱角化した胚を扱えるように、標本を接着剤の上に慎重に一列に並べます。

カバーガラスを脱水チャンバーに移し、胚を部分的に乾燥させます。これにより、注射中または注射後の細胞質漏出を防ぐことができます。次に、カバースリップを取り外し、胚をハロカーボンオイルで覆って、酸素が胚に拡散するのを防ぎながら、さらなる脱水を防ぎます。

マイクロインジェクションを行うには、互換性のある顕微鏡でマイクロインジェクションシステムを使用します。目のピースを通して見ることにより、胚と注射液がプリロードされた針の両方を特定します。針を折って開き、一貫した適切なサイズの液滴が生成されることを確認します。次に、針を胚の中に入れ、適切な量を注入します。針を取り出し、残りの胚に対して注射を繰り返しながら、次の針に進みます。

プロトコル例では、細胞分裂のライブイメージング研究のためのショウジョウバエ胚マイクロインジェクションのデモンストレーションを見ていきます。

- カバースリップをセットする前に、二重粘着テープを広げてヘプタン接着剤を作り、100ミリリットルのボトルに入れます。約50ミリリットルのヘプタンを加え、ボトルを密封し、数日間揺らします。

胚を準備する前に、注入前に胚を配置する脱水チャンバーを作成します。これを行うには、35ミリメートルの皿の一部を100ミリメートルのシャーレの中に入れて「テーブル」を作ります。無水硫酸カルシウムであるドリエライトを周囲に加え、ドライエライトの高さが「テーブル」より高くならないようにし、覆います。

胚の準備を始めるには、まずグレープジュースプレートを酵母と交換して、産卵ケージから胚を集めます。胚は、収集開始から約2時間後に画像化する必要があります。カバースリップを準備するには、顕微鏡スライドの片側に置き、四隅をテープで留めて動かないようにします。

綿の先端のアプリケーターを使用して、ヘプタン接着剤の1つの層をカバーガラスに一列に並べます。接着剤は粘性であってはならず、数秒で乾くはずです。濃すぎる場合は、ヘプタンを追加してください。

最後に、カバーガラスの横のスライドに二重粘着テープを貼ります。湿らせたブラシで、グレープジュースプレートから胚を慎重に拾い上げ、スライド上の二重粘着テープに置きます。

次に、ピンセットの半分を使用して、絨毛膜が開くまで胚を二重粘着テープ上で転がします。胚を絨毛膜の上で静かに転がしてピンセットにくっつくようにして胚を拾い上げ、胚の長辺をカバーガラスの長辺と平行にして、カバーガラスのヘプタン接着剤の上に置きます。

10〜20個の胚を一列に置きます。カバースリップを取り外し、脱水チャンバーに3〜8分間置きます。時間は、地域の湿度と注入する量によって異なります。次に、カバーガラスを真空グリースの入った金属チャンバーに置きます。最後に、胚をハロカーボンオイルで覆い、さらなる脱水症状を防ぎます。これで、胚を注入する準備が整いました。

まず、16倍の対物レンズの下で胚を見つけます。胚を遠ざけ、焦点面を動かさずに針を見つけます。針を中央に配置し、X方向またはY方向に動かさずに上に移動します。

針を開くには、カバーガラスの端を視野に入れますが、針がある場所には入れず、針を同じ焦点面に下げます。非常に慎重に、カバースリップが針に当たってそっと開くまでカバースリップを動かします。針を上に動かします。

次に、胚を視界に入れます。針をオイルに下げ、針からきれいな液滴が得られることを確認してください。胚を針にしっかりと移動させ、胚に一滴注入してから、胚を遠ざけます。すべての胚を注入した後、60倍または100倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡で観察する準備が整います。