Name: のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法でショウジョウバエ末梢ニューロンを単離し、高品質なRNAを抽出する技術です。神経科学研究における遺伝子発現解析に応用可能です。

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我々は、博士に感謝する。 LCMの支援のために本研究で使用したフライ株式、およびバージニアEspina、博士エマニュエルPetricoinと博士ランスリオッタを提供するための塩原-ティンニン月とウェスGrueber。著者らはこの研究の支援（DNC）とジョージメイソン大学の学長のオフィス（EPRI）のためにトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストを認める。

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting%2C+for+use+in+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li>
<li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li>
<li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li>
<li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4%2B+and+CD8%2B+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li>
<li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR%3A+An+emerging+technology+hits+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li>
<li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li>
<li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li>
<li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li>
<li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li>
<li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling%3A+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

本明細書において提示されるプロトコルは、LCMを経由してショウジョウバエ末梢神経細胞の単離のための私達の最適化方法を説明します。このLCMプロトコルが開発の三齢幼虫の段階から、単一の、クラス固有のまたは複数のショウジョウバエ DAニューロンの特定の単離のために設計されたものですが、プロトコルのマイナーな修正は、容易に全ての発生から他のショウジョウバエの細胞型のキャプチャのために適合させることができる細胞のタイプや金利の種類のラベルの異なるGAL4、UAS - mCD8 - GFPレポーター導入遺伝子を使用してステージ。我々の結果は、レーザーキャプチャーマイクロ解剖DAニューロンから得られたRNAは定量RT - PCRやマイクロアレイベースの分析では潜在的な直接使用を可能にする非常に高品質であることを示している。 LCMは、機能喪失（UAS - RNAi）をおよび/ ​​またはGAL4を採用した機能獲得型研究と組み合わせて使用することができる場所、ここで説明したようにこのプロトコルのアプリケーションは、興味のある野生型細胞の捕獲を越...

設備： <ul><li>クライオスタット</li><li>スライド固定、洗浄、トリプシン処理、エタノール/キシレン脱水の場合は50 mlコニカルチューブ</li><li> -80℃の冷凍庫</li><li>インキュベーター</li><li> PixCell IIE LCMのインストゥルメントは、フルーアで300落射蛍光光学系は、EGFP（モレキュラーデバイス分子デバイス）用に最適化</li></ul>

のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

ショウジョウバエ末梢神経系（PNS）の樹状分枝（DA）ニューロンはクラス特有の樹状突起の形態形成の1,2の分子メカニズムを調査するための優れたモデルシステムを提供しています。クラス固有のDAニューロンの発達の分子解析を容易にするために、それは純粋な集団で、これらの細胞を得ることが不可欠です。異なる細胞、および組織特異的なRNAの分離技術の範囲は、磁気ビーズをベースセル精製3,4、蛍光活性化細胞選別（FACS）5-8、およびRNA結合タンパク質に基づいて戦略を9日のなしを含むショウジョウバエの細胞にもありますが、これらのメソッドは、容易に空間的な精度の高い単一または複数のクラス固有のショウジョウバエ DAニューロンを単離するために利用することができます。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、空間分解能と高精度に組織切片から特定の細胞型を分離するために使用できる非常に強力なツールとして登場しました。単離された細胞から得られたRNAは、その後、定量RT - PCRおよび特定の細胞型10月16日内マイクロアレイの発現プロファイリングを含む、解析に使用することができます。日付に、LCMは広く開発の三齢幼虫期におけるDAニューロンを含むショウジョウバエの組織や細胞17,18、の分析に適用されていない。 ここでは、LCMの赤外線（IR）クラスを使用してショウジョウバエの DAニューロンの単離のために私達の最適化されたプロトコルを提示する。このメソッドは、高い特異性と空間分解能を持つ単一の、クラス固有のまたは複数のDAニューロンのキャプチャが可能になります。年齢をマッチさせたUAS - mCD8を表現する三齢幼虫：：クラスIV DAニューロンの特定のPPK - GAL4 20ドライバーまたはパン- DAニューロン固有のどちらの制御下にGFP 19遺伝子21 - 7 - GAL4 21ドライバは、これらのために使用された実験。孤立したDAニューロンから得られたRNAは非常に高品質のものであり、直接定量RT - PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用できます。さらに、このLCMプロトコルが容易にGFPの細胞型特異的、GAL4 -ドリブン発現パターンに応じて、さまざまな開発段階に依存する他のショウジョウバエの細胞タイプをキャプチャするために適応させることができます。

このビデオ、記事では、単一または複数単離するための方法を提示<em&gt;ショウジョウバエ</em赤外線キャプチャ（IR）レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のクラスを使用して、三齢幼虫から&gt; DAニューロン。分離された神経細胞から得られたRNAは、容易に定量RT - PCRやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用することができます。

ショウジョウバエ（Drosophila）の末梢神経系（PNS）における樹状分枝（dendritic arborization; da）ニューロンは、...を研究するための優れたモデルシステムとなります。

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、組織切片から特定の細胞型を高い空間分解能と精度で単離できる極めて強力なツールとして登場しました。本動画では、LCMを用いて3齢のDrosophila larvaeから末梢ニューロンを切り出します。3齢幼虫をクライオモールドに埋入して凍結させた後、クライオスタットを用いて連続組織切片を作成し、これをガラススライド上に配置して解凍し、70% ethanolで固定します。次に、スライドをトリプシンでインキュベートして残留した幼虫のクチクラを除去し、エタノール系列による脱水およびキシレンでの透明化を行います。続いて、組織切片にLCMキャップを配置し、パルスレーザーを用いて特定の蛍光標識ニューロン細胞を回収します。最後に、回収した細胞からRNAを単離し、定量R-T-P-C-Rやマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに供します。こんにちは。ジョージ・メイソン大学分子微生物学部およびクラスノウ高等研究所のDan Coxです。こんにちは。Dan Cox博士の研究室のIsh AERです。本日は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を用いた、単一または複数のショウジョウバエ末梢ニューロンの細胞分離およびRNA精製の手順について解説します。当研究室では、クラス特異的なDIN率形態形成を媒介する分子メカニズムを研究するために本手順を用いています。それでは、始めていきましょう。このビデオで示すすべての手順は、標準的な手順に従い、厳格なRNaseフリー条件下で実施されています。このプロトコルは、30から40匹の成熟した3齢幼虫を採取することから始めます。幼虫を二回蒸留水で洗浄してください。RNAs awayで短時間すすいだ後、さらに二回蒸留水で一度洗浄します。RNAs awayを除去するため、清潔なキムワイプを用いて余分な水分を完全に吸い取ります。次に、清潔な組織包埋用モールドを用意し、OCTを薄く一層加えます。型を氷の上に置き、0 °Cまで冷却します。ピンセットを使用して、洗浄した幼虫と冷やしたOCTを配置します。OCTの低温により、幼虫の動きを抑制することができます。包埋プロセスにおいて、幼虫を互いに平行に配置します。幼虫の配置が完了したら、幼虫を動かさないように注意しながら、型にOCTをゆっくりと満たします。次に、急速冷凍します。ドライアイスの上に配置して、型を凍結させます。これにより、幼虫を単一平面上に配置することができ、1切片あたりの細胞数を最大化できます。クライオスタットを使用します。ラベル付きの電荷なしRNAフリーガラス顕微鏡スライドに、5〜8 µmの厚さで凍結切片を作製します。スライドをドライアイスで保管し、その後、マイクロダイセクションを行うまで-80 °Cで保存します。脱水に使

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

レーザーマイクロダイセクションは、ローカライズされたRNAi実験に供ショウジョウバエの翅のディスクの特定のコンパートメントでの遺伝子発現プロファイリングの解析に適用した...

から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

人間の神経前駆細胞（NPCの）が増殖している条件の下で拡大した。のNPCは、ニューロトロフィンの組み合わせの存在下での神経細胞が豊富な培養物に分化させた。ニューロンのマーカーは、免疫蛍光染色により検出した。ニューロンの純粋な集団を単離するために、PENのNPCは、メンブレンスライドに分化し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを行った。...

文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

ここ半無傷でモータ出力の変化（筋収縮）を監視しながら、我々は運動神経活動のoptogenetic操作のためのプロトコルを記述...

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。...

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

個々のドーパミンニューロンの単離または直接または間接的な免疫組織化学との腹側被蓋領域は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて実証されている。赤外線レーザーを用いてガラススライドから組織を単離するため、赤外および紫外レーザーの組み合わせを使用して膜のスライドからパラメータが議論されている。...

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

ここでは、ショウジョウバエ幼虫脳の生体調における高刺激性樹状フィロポディアの画像化に用いた方法と、デンドライトの定量的評価のためのタイムラプス3Dイメージングデータセットを定量化するために開発したプロトコルについて説明します。ニューロンの発達におけるダイナミクス。...

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。...

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ...

無傷の ショウジョウバエ 幼虫のレーザー細胞アブレーションにより、シナプスの競合が明らかになる

学ぶレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法でショウジョウバエ末梢ニューロンを単離し、高品質なRNAを抽出する技術です。神経科学研究における遺伝子発現解析に応用可能です。

のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

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