のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションショウジョウバエ末梢ニューロン

レーザーキャプチャーMICRODISSECTIONまたはLCMは、高度な空間分解能と精度で組織切片から特定の細胞タイプを分離するために使用できる非常に強力なツールとして浮上しています。ここでは、LCMを使用して、3番目のinstar oph幼虫から末梢ニューロンを解剖します。3齢の幼虫をクライオ型に埋め込んで凍結し、その後、連続組織切片を切断するためにクライオ状態にし、それをスライドガラス上に置き、解凍して70%エタノールで固定します。

次に、スライドをトリプシンとインキュベートして、残留した幼虫のキューティクルを除去し、エタノール勾配とキシレンクリアリングによる脱水を行います。次に、LCMキャップを組織切片に置き、パルスレーザーを用いて選択的蛍光ニューロン細胞を捕捉します。最後に、RNAは捕捉された細胞から単離され、定量R-T-P-C-Rやマイクロアレイ分析などのダウンストリームアプリケーションに使用されます。

こんにちは、ジョージ・メイソン大学の分子微生物学部およびクラスノウ高等研究所のダン・コックスです。こんにちは、Dr.Dan Coxの研究室のIsh AERです。本日は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、単一または複数のショウジョウバエ末梢ニューロンの細胞単離とRNA精製の手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、クラス特異的なDINレートの形態形成を媒介する分子メカニズムを研究しています。それでは始めましょう。このビデオに示されているすべての手順は、標準的な手順に従って、厳密にRNAを含まない条件で実行されます。

このプロトコルは、30〜40のエイジドマッチを集めることから始めます。3番目の幼虫。幼虫を二重蒸留水で洗います。

RNAで短時間洗い流し、次に再蒸留水でもう一度洗浄します。RNAを除去するには、清潔なKimワイプを使用して、余分な水分を完全に吸い取ります。次に、きれいなティッシュ包埋型を取り、OCTの薄層を追加します。

型を氷のブロックに置き、摂氏0度に冷まします。鉗子を使用して、きれいな幼虫と冷たいOCTを置きます。OCTの低温は、幼虫の動きを減らすのに役立ちます。

埋め込みプロセス中に、幼虫を互いに平行に配置します。幼虫が配置されたら、邪魔をせずにゆっくりと型にOCTを入れます。次のスナップ。

型をドライアイスの上に置いて凍結します。これにより、幼虫が単一の平面に沿って配置されるようになり、セクションごとに使用可能なセルの数が最大になります。クライオスタットを使用する。

透明で標識された非荷電RNAフリーガラス顕微鏡スライド上で、5〜8マイクロメートルの厚さで凍結切片を切断します。スライドをドライアイス上に保管し、マイクロダイセクションの準備が整うまで摂氏マイナス80度に移します。脱水症のすべての溶液は、各LCMセッションの前に新たに調製する必要があります。

凍結した幼虫組織切片の完全な脱水は、最適なマイクロダイセクション効率を達成するために不可欠です。凍結した幼虫組織切片を含むスライドをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、ドライアイスの上に置きます。スライドボックスからスライドを1つ取り出し、すぐに70%エタノールで満たされた50ミリリットルの円錐形チューブに3〜10秒間入れます。

次に、RNAを含まない二重蒸留水で満たされた50ミリリットルの円錐管でスライドを5〜10秒間すすぎ、LCMキャプチャを妨げる可能性のある組織切片からキューティクルを取り除きます。50マイクロリットルの2.5%トリンを直接組織切片に静かにピペットで移し、室温で5〜30秒間インキュベートし、RNA、遊離二重蒸留水を含む50ミリリットルの円錐管で切片を短時間すすぎ、トリプシンと緩く付着したキューティクルの断片を取り除きます。スライドを次の溶液に順番に浸して、脱水プロセスを完了します。

70%エタノール95%エタノール、100%エタノール、100%エタノール、100%キシレン。そして最後に、100%キシレンでもう一度。脱水後、スライドを温和な気流の下で室温で60〜120秒間完全に乾燥させます。

可能であれば、湿度が管理された部屋でマイクロダイセクションを行い、湿度の上昇による効率の低下を防ぎます。まず、顕微鏡とレーザーコントロールボックスの電源を入れます。キャップホルダーアセンブリにキャップをHSCLCMキャップでロードします。

各キャップは、多数の細胞体を捕捉することができます。次に、分子デバイスソフトウェアを開き、スライド番号やキャップロット番号などの実験の詳細を入力します。幼虫組織切片を載せたスライドを顕微鏡ステージに置き、マイクロダイセクションを行います。

新しいHS LCMキャップをカートリッジからPセル2 ELCM装置にロードし、ジョイスティックに対して正しく配置して、キャプチャ領域に対するキャップの適切な位置を確保し、PPK GAL 4 U-A-S-M-C-D 8 GFPまたは21 7 G 4 UASM CD 8 GFPトランスジェニックレポートラインで蛍光標識細胞を見つけます。末梢神経系の樹状突起ニューロン、樹状突起ニューロン、またはDAニューロンは、GFP蛍光によって容易に同定できます。特異性を最大限に高めるには、蛍光シグナルが強く、細胞の重複が最小限に抑えられた細胞を選択します。

次に、レーザーパルスの出力と持続時間を調整して、単一クラスDAニューロンのマイクロ解剖用に選択したレーザースポットサイズに対応するサイズの正確な溶融ポリマースポットを実現します。次の設定をお勧めします。スポット直径7.5マイクロメートル、レーザー強度、30〜50ミリワットのレーザー時間、2〜4ミリ秒、セルあたり1〜2ショット。

レーザーの設定は、使用する組織の種類、組織の厚さ、および使用するLCMキャップの種類によって異なる場合があります。最終的に、レーザー設定では、最適なキャプチャ結果を得るために経験的テストが必要です。次に、組織をLCMにかけます。

LCM中、キャップは対象領域と低出力赤外線レーザーの上に配置されます。パルスは、キャップを通じて目的の細胞の上にある薄いサーモラボポリマーフィルムに向けられます。レーザーをパルス化すると、フィルムは軟化し、標的細胞に付着し、目的の細胞が付着して固化します。

キャップを組織切片から持ち上げると、細胞は周囲の組織からマイクロダイセクトされ、より多くの細胞を新しいフィールドに捕捉し、このプロセスを繰り返します。目的の細胞が捕捉されたら、LCMキャップを持ち上げて清潔なスライドに置き、捕捉された細胞の存在と不要な細胞や破片がないことを確認します。蛍光照明と透過光照明を使用してHS LCMキャップを画像化します。

マイクロ解剖細胞を含むキャップをデバイスの抽出物に取り付けます。次に、キャップ表面に12マイクロリットルのRNA抽出バッファーを追加し、ここに示すように逆さまの薄肉反応チューブを接続します。アセンブリをアライメントトレイに置き、予熱したインキュベーションブロックで覆います。

次に、インキュベーション遠心分離機の後、トレイを摂氏42度のインキュベーターに30分間置きます。抽出物を含むチューブを重力の800倍で2分間。遠心分離機からチューブを取り出した後、チューブを閉じ、細胞抽出物を摂氏マイナス80度で保存し、RNA抽出物を精製し、RNAをカラム精製します。

ピコピュアRNA抽出キットの指示書によると、DNAの処理はオプションであり、必要に応じてRNA精製中にカラム上で行うことができます。RNAが精製されたら、マイナス80°Cで保存します。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、3番目の幼虫から単一クラス特異的または複数のショウジョウバエDAニューロンを分離しました。

LCMは、ショウジョウバエDニューロン細胞体の単離において、高い精度と特異性を可能にします。ここに示されているのは、脱水およびトリプシン処理された8ミクロンの組織切片の代表的な画像です。LCMを実行する前に、2つのクラス4のDAニューロンをGFPで標識します。

矢印は、キャプチャーのために強調表示されているニューロンを示します。強調表示されたニューロンの細胞体は、組織切片から高い特異性できれいにマイクロ解剖されます。この昆虫は、LCMキャップに捕捉された単一のクラス4 DAニューロンのエンドンビューを示しています。

単離されたDAニューロンから精製された全RNAは、シャープな5.8 SASおよび28 sリボソームの存在によって示されるように、優れた品質であることがわかりました。ニューロン遺伝子特異的マーカーのAgilent 2100バイオアナライザーリアルタイム定量的逆転写PCRで分析すると、RNAがピークに達します。Levは、デルタデルタCT法を使用して単離された細胞のニューロン特異的濃縮を評価するために実施されました。これにより、動物全体と比較して、LCMで捕捉されたDAニューロンのレベルに2.5倍を超える濃縮が見られました。

キャプチャーマイクロダイセクションを使用して、Jossまたは末梢ニューロンからRNAを分離および精製する方法を示しました。この手順を行うときは、切片の厚さでマイクロ解剖する組織に応じて、トリプシン濃度と消化時間を最適化することが重要です。インキュベーション時間が長いと、組織切片から目的の細胞が失われる可能性がありますが、インキュベーション時間が短いと、幼虫のキューティクルの除去には不十分になり、LCMが非効率的になる可能性があります。

重要なことは、すべての組織脱水溶液は新たに調製されなければならないということです。また、LCMキャップの損傷を防ぐために、LCMの前にポリマーキシレンを完全に蒸発させる必要があります。最後に、精製した細胞からRNAの完全性を維持するためには、手順全体を通してRNAの事前条件を維持することが不可欠です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。