カルシウムイメージング:生きたC.エレガンスの神経活動を可視化する方法

- GCaMP(カルシウム感知タンパク質)を発現するトランスジェニック線虫1体を、線虫の細菌性食物と共にイメージングチャンバーに入れます。次に、蒸発を防ぐために、蓋と実験用フィルムで皿を密封します。広視野落射蛍光に対応した複合顕微鏡で観察します。線虫のタイムラプス画像を記録して、その行動を追跡し、イメージングソフトウェアを使用して蛍光を捕捉します。

トランスジェニック線虫は、特定のニューロンでGCaMP発現を駆動するプロモーターの制御下でGCaMPセンサータンパク質を発現します。そのニューロンが活性化されると、活動電位が発火し、原形質膜が脱分極します。脱分極すると、電位依存性カルシウムチャネルが原形質膜で開きます。これにより、カルシウムイオンが細胞内に流入し、ニューロンが興奮します。

興奮したニューロンのGCaMPはカルシウムイオンに結合します。これにより、線虫を低強度の蛍光励起光で画像化すると、GCaMPが蛍光を発します。このプロトコル例では、カルシウムイメージングを使用して、アガロースマイクロチャンバー内のトランスジェニック線虫におけるAVA介在ニューロン活性を可視化します。

- カルシウムイメージングは、広視野落射蛍光機能を備えた複合顕微鏡で行います。光の露出を制限するには、カメラがフレームを記録すると同時にLEDをトリガーしてサンプルを照らすトランジスタトランジスタロジック信号を使用します。

バーストムービーを 24 時間実行し、各ワームを 15 分から 30 分ごとに撮影します。まず、DICで20秒、次にGFP蛍光で20秒を記録し、最後に、コントロール発現レベルのmKate2シグナルの画像を記録します。

目視データ検査では、偽カラーマップを使用して、蛍光強度の小さな変化の視認性を高めます。最後に、標準的な手順を使用してカルシウムデータ分析を実行します。