0 閲覧数 • 4:21 分 • April 30th, 2023
- エクソソームは、脂質、タンパク質、DNA、mRNA、マイクロRNAなどの生体分子を運ぶ小さな膜結合小胞です。エキソソームは、異なる細胞タイプによって細胞外空間に放出され、血漿などの生体流体から単離することができます。
まず、血漿サンプルを遠心分離して細胞と破片を取り除きます。血漿上清を新しいチューブに移します。.血漿を所望の濃度のリボヌクレアーゼ酵素で処理します。サンプルを摂氏37度の加熱ブロックで適切な時間インキュベートします。
この酵素は、サンプル中の遊離RNAを分解しますが、エキソソームRNAは保護されたままです。PBSを使用してサンプルを希釈します。次に、所望の濃度のプロテイナーゼK酵素溶液を添加し、摂氏37度で適切な時間インキュベートします。プロテイナーゼKは、血漿タンパク質の大部分を分解します。また、以前に添加されたリボヌクレアーゼ酵素を不活性化するため、下流のプロセシング中のエキソソームRNA分解のリスクを排除します。
血漿からのエキソソーム分離を容易にするために、適切な量のエキソソーム沈殿バッファーを添加します。サンプルを遠心分離して、無傷のエキソソームを含むペレットを取得します。単離されたエキソソームは、RNAやタンパク質抽出などの下流ステップに応用できます。
次のプロトコルでは、非小細胞肺がん患者の血漿サンプルからエキソソーム分離を行います。
- まず、1ミリリットルの血漿サンプルを氷上で解凍します。解凍したら、チューブを数回反転させて、形成された可能性のある凍結沈殿物を分解します。次に、血漿を室温で20分間遠心分離し、細胞と破片を除去します。上清を収集し、血漿を再度遠心分離し、今度は10,000Gで20分間遠心分離します。再度、血漿上清を収集し、今度はRNAseの10マイクロリットルを追加します。プラズマを摂氏37度でサーマルブロックヒーターで10分間インキュベー
トします。- 遊離microRNAを分解するために、標準キットプロトコルにRNAse処理ステップを追加しました。その後、キットプロトコルに含まれるプロテイナーゼK処理ステップは、RNAseを分解し、エキソソームマイクロRNAの完全性を保護するために利用されました。
- 次に、プラズマを1x PBSの半分の容量で新しいチューブに移し、ボルテックスします。次に、0.05容量のプロテイナーゼK溶液を加え、サンプルを再度ボルテックスし、摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、0.2容量のエキソソーム沈殿バッファーを追加し、サンプルを反転して混合します。次に、サンプルを摂氏4度で30分間インキュベートします。
コールドインキュベーション後、サンプルを10,000 Gで室温で5分間遠心分離します。上清の20〜50マイクロリットルのアリコートを取り、制御目的で保管します。次に、残りの上清を吸引して廃棄します。
エキソソームペレットを選択したバッファーに、下流の分析に応じた容量で再懸濁します。RNA解析には、RNA抽出用の特異的溶解バッファーを添加します。
本記事では、血漿サンプル、特に非小細胞肺癌患者からのエキソソームの単離について解説します。エキソソームは、さまざまなバイオ分子を運搬し、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たす小さな小胞です。
血漿からの信頼性の高いエクソソーム分離により、非侵襲的な分子バイオマーカーへのアクセスが可能となり、腫瘍学研究における早期検出および経時的なモニタリングが推進されます。このワークフローは、エクソソーム内のRNAおよびタンパク質の完全性を維持することで、バイオマーカー探索およびトランスレーショナル研究における予測の信頼性を向上させます。本手法により、エクソソームを用いたリキッドバイオプシーが、ポートフォリオ全体のバイオマーカー検証および疾患進行追跡のためのスケーラブルなツールとして位置づけられます。
このエクソソーム分離プロトコルは、探索生物学とトランスレーショナルリサーチの接点を統合するものであり、初期のバイオマーカー同定から前臨床検証に至るまでのワークフローを支援します。
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最終更新:29 8月 2026