エクソソーム単離:非小細胞肺癌患者の血漿からエクソソームを分離する技術

- エクソソームは、脂質、タンパク質、DNA、mRNA、マイクロRNAなどの生体分子を運ぶ小さな膜結合小胞です。エキソソームは、異なる細胞タイプによって細胞外空間に放出され、血漿などの生体流体から単離することができます。

まず、血漿サンプルを遠心分離して細胞と破片を取り除きます。血漿上清を新しいチューブに移します。.血漿を所望の濃度のリボヌクレアーゼ酵素で処理します。サンプルを摂氏37度の加熱ブロックで適切な時間インキュベートします。

この酵素は、サンプル中の遊離RNAを分解しますが、エキソソームRNAは保護されたままです。PBSを使用してサンプルを希釈します。次に、所望の濃度のプロテイナーゼK酵素溶液を添加し、摂氏37度で適切な時間インキュベートします。プロテイナーゼKは、血漿タンパク質の大部分を分解します。また、以前に添加されたリボヌクレアーゼ酵素を不活性化するため、下流のプロセシング中のエキソソームRNA分解のリスクを排除します。

血漿からのエキソソーム分離を容易にするために、適切な量のエキソソーム沈殿バッファーを添加します。サンプルを遠心分離して、無傷のエキソソームを含むペレットを取得します。単離されたエキソソームは、RNAやタンパク質抽出などの下流ステップに応用できます。

次のプロトコルでは、非小細胞肺がん患者の血漿サンプルからエキソソーム分離を行います。

- まず、1ミリリットルの血漿サンプルを氷上で解凍します。解凍したら、チューブを数回反転させて、形成された可能性のある凍結沈殿物を分解します。次に、血漿を室温で20分間遠心分離し、細胞と破片を除去します。上清を収集し、血漿を再度遠心分離し、今度は10,000Gで20分間遠心分離します。再度、血漿上清を収集し、今度はRNAseの10マイクロリットルを追加します。プラズマを摂氏37度でサーマルブロックヒーターで10分間インキュベー

トします。

- 遊離microRNAを分解するために、標準キットプロトコルにRNAse処理ステップを追加しました。その後、キットプロトコルに含まれるプロテイナーゼK処理ステップは、RNAseを分解し、エキソソームマイクロRNAの完全性を保護するために利用されました。

- 次に、プラズマを1x PBSの半分の容量で新しいチューブに移し、ボルテックスします。次に、0.05容量のプロテイナーゼK溶液を加え、サンプルを再度ボルテックスし、摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、0.2容量のエキソソーム沈殿バッファーを追加し、サンプルを反転して混合します。次に、サンプルを摂氏4度で30分間インキュベートします。

コールドインキュベーション後、サンプルを10,000 Gで室温で5分間遠心分離します。上清の20〜50マイクロリットルのアリコートを取り、制御目的で保管します。次に、残りの上清を吸引して廃棄します。

エキソソームペレットを選択したバッファーに、下流の分析に応じた容量で再懸濁します。RNA解析には、RNA抽出用の特異的溶解バッファーを添加します。