細胞外フラックスアッセイ:細胞の代謝プロファイルを測定する方法

- 細胞外フラックスアッセイは、解糖系とミトコンドリア呼吸という2つの主要なエネルギー経路を測定することにより、細胞代謝の研究に役立ちます。解糖中、細胞はグルコースを代謝し、プロトンとともに乳酸を細胞外空間に分泌します。これは、細胞外酸性化率またはECARを測定することによって決定されます。ミトコンドリア呼吸中、細胞は酸素消費率またはOCRを決定することによって測定されるATP産生に酸素を利用します。

がん細胞は、代謝率を変化させて無秩序な細胞増殖を適応させ維持するため、高いグルコース取り込みを示します。がん細胞の代謝を解析するには、まずがん細胞単層を付着させたフラックス分析マイクロプレートと水和センサーカートリッジを組み立てます。プレートアセンブリをフラックスアナライザーに移します。アナライザ内では、センサープローブが下降して過渡的なマイクロチャンバーが形成されます。細胞外フラックスを測定するために、注入ポートは、あらかじめ設定された時点で試験化合物をマイクロプレートに導入します。

細胞代謝に基づいて、マイクロチャンバーで利用可能な酸素濃度とマイクロチャンバー内で放出される陽子の濃度は変動します。カートリッジの基部に埋め込まれた2つの蛍光色素は、酸素レベルとプロトンレベルを同時に感知して測定し、それぞれミトコンドリア呼吸と解糖系を示します。次のプロトコルでは、初代白血病細胞の代謝活性を測定するための細胞外フラックスアッセイを実演します。

- 一方、細胞外フラックス分析用のプレートを準備するために、2つの8ウェル細胞外フラックス分析プレートの各ウェルに12.5マイクロリットルの細胞接着溶液を追加します。20分後、細胞接着剤を吸引し、洗浄ごとに200マイクロリットルの滅菌水で各ウェルを2回洗浄します。

2回目の洗浄後、ウェルが乾くまでプレートをフードに入れたままにし、センサーカートリッジを逆さまにしてラボベンチに置きます。ユーティリティプレートとフラックスアナライザーのセンサーカートリッジを分離し、ユーティリティプレートの各ウェルに200マイクロリットルのキャリブラントを充填し、ウェルの外側の周りの各堀に400マイクロリットルのキャリブラントを充填します。

センサーカートリッジをキャリブラントが含まれているユーティリティプレートに戻し、カートリッジアセンブリをCO37を含まない摂氏2度の加湿インキュベーターに一晩置きます。次に、細胞外フラックスアナライザーの電源を入れ、一晩で摂氏37度まで温めます。

翌朝、細胞をフラスコから50ミリリットルのコニカルチューブに移して遠心分離し、ペレットを適切な実験培地1ミリリットルに再懸濁してカウントします。実験培地濃度400μL中に細胞を6細胞の4倍から10倍で再懸濁し、フラックス分析プレートのBからGまでのウェルに50μLの細胞を、バックグラウンドコントロールウェルとして実験培地180μLをAとHのウェルに加える。

遠心分離後、130マイクロリットルの実験培地をウェルBからGにゆっくりと慎重に加え、顕微鏡下で各ウェルの底部に細胞が安定して付着していることを視覚的に確認します。次に、フラックス分析プレートを加湿した摂氏37度のインキュベーターにCO2なしで30分間戻します。

インキュベーション終了の20分前に、表に示されている実験プロトコルに従って、化合物をカートリッジの適切なインジェクターポートにロードします。次に、適切な細胞外フラックス解析プログラムを設定します。プログラムを開始し、プロンプトが表示されたら、キャリブラントプレートをアッセイプレートに交換します。