Name: マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 38 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイス製造と海洋微生物の走化性応答。マイクロチャンネルで栄養勾配を制御し、Dunaliella tertiolectaの餌探索行動と剪断流中の細菌遊泳を解析する手法を解説。生態学的役割の理解に貢献。

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私たちは、クリーンルーム施設内のこのビデオのフィルムの部分に私たちを可能にするため、MITのマイクロ技術研究所に感謝したいと思います。

準備 1。マスクを作成する<blockquote> CADソフトウェアを使用して、透明で高解像度印刷用のチャネルを設計する。これは、&quot;マスク&quot;になります。 </blockquote>クリーンルーム内で： 2。ウェハをクリーニングして焼くアセトンと、その後すぐにメタノールで、その後、イソプロパノールで最初に、噴出ウェハ。最後に、窒素を用いてウェハを乾燥させる。 5分間、オーブン（130℃）でウエハを焼く。 3。コー​​ティングウェハースピンコーティングマシンの中心にウェハを置きます。ウェハ上に瓶から注ぐフォトレジスト（SU - 8）。 SU - 8の流れを聞かせて〜10秒間リラックススピンコーターをオンにして、5秒かけて0から500 rpmにその速度を増加させる、10秒間、500rpmで維持、10秒以上の最終的な速度まで上昇し、30秒のために最終的な速度で維持する最終速度は、使用されるターゲットコーティングの厚さとSU - 8によります。詳細はで見ることができます<a href="http://www.microchem.com/">http://www.microchem.com/</a> 4。ソフトベークコー​​ティング後のウェーハは、° C、その後95℃65℃最初にそれを焼く℃に焼成時間は、ターゲットの厚さと使用されるフ​​ォトレジストの種類によって異なります。その後、ウェーハは、少なくとも5分間室温で放置します。 5。露出ウェハの上にマスクを配置し、SU - 8のマニュアルで推奨されている時間のために紫外線にウェハを公開。 6。露光後ベーク 65でウエハを焼くその後° Cおよび95 ° C以下のSU - 8のマニュアルの指示に従ってください。 7。 &quot;マスター&quot;（金型）を取得するためにウェーハを開発開発者（PMMA）で満たされたビーカーを準備します。フォトレジストの未露光部分は洗い流されるまで、非常に静かにビーカーを発振しながらビーカーにウェハを浸し。 私たちの研究室で： 8。 PDMSを準備して、ウェハ上に注ぐカップに10:1の比では硬化剤とPDMSを混ぜる。かき混ぜ、それが均質に混合する：これは、気泡をたくさん生成し、混合物が不透明に見えるようになります。 &quot;マスター&quot;の混合物を注ぐ。 9。真空チャンバー内の脱泡気泡を除去するため、すべての泡がなくなるまで真空チャンバ内にそれをカバーしているマスターとPDMS混合物を置く。 10。オーブンでベーキング 65℃硬化PDMSのオーブンで少なくとも12時間焼く。 11。パンチ穴チャンネルのインレットとアウトレットのためのマスターとパンチ穴からPDMS剥離。 クリーンルーム内（図示せず） 12。プラズマボンディングチャネルは、PDMS層と1分間の酸素プラズマによるガラスのスライドの両方を処理した後、スライドガラスに接着されている。 実験： EXP＃1：マイクロスケールの栄養素層への海洋微生物の走化性応答の調査 1）実験のセットアップ<ol><li>ガラスシリンジに生物と基板を追加します。 </li><li>顕微鏡ステージ上にマイクロ流体チャネルを置き、適切なインレットとアウトレットにチューブを取り付け</li><li>貯水池を無駄にチューブを接続します。チューブが完全に圧力の振動を避けるために、廃液溜めに流体に浸漬されていることを確認します</li><li>シリンジポンプにシリンジを配置し、バルブとチューブに接続</li><li>光条件、倍率等：顕微鏡を設定する</li><li>チャンネル内の適切な位置に焦点を当てる</li><li>人工海水で満たされた大きな注射器を使用してデバブルチャネル</li><li>シリンジポンプの適切な流量を設定します。この場合のチャネルで220μmのs -1の平均流速に対応し2ml /分、 </li></ol> 2）実験の実行<ol><li>チャンネル内の栄養勾配を確立するためにシリンジポンプを起動します。 </li><li>流れが安定していると栄養素のバンドが開発されると、シリンジポンプにフローを停止し、この時点から時間の録音を開始</li><li>栄養バンドは、横方向に拡散し始めます</li><li>定期的な時間間隔で、&quot;ムービー&quot;を作成するフレームのシーケンスを記録するために画像解析ソフトウェアを使用</li><li>私たちは動いていない粒子とバックグラウンドノイズから運動性の細胞を区別できるように、これだけ移動するオブジェクトが現在可視であることを、2つの後続のフレーム間の時間差画像を取ることによって泳ぐ生物を区別する</li><li> Pへの参照を使用して、チャネル内のセルの位置を決定するために映画を取る栄養パッチのosition </li><li> 10-20分のための定期的な間隔で記録映画は、位置と生物の遊泳パターンを分析する</li><li>別のフレーム（各ピクセルに映画の期間にわたってそのピクセルで記録された最大光強度を割り当てる）で生物の位置を重ね合わせ画像解析ソフトを使用することにより、我々は、水泳の細胞のための軌道情報を取得することができます</li></ol> EXP＃2：vortexZで泳いでいる海洋細菌に対する剪断の影響を調査<ol><li>別のチャネル形状を使用して、我々は異なるせん断速度でボルテックスで泳いで細菌の挙動を観察することができます</li></ol>

<ol><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+explicit+simulations+of+a+microbial+food+web.+%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Spatially explicit simulations of a microbial food web. </a> Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+plankton+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282, 2254-2256 (1998).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).</li>
<li>Marcos,, Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+in+vortices%3A+a+microfluidic+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Microorganisms in vortices: a microfluidic setup.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).</li>
<li>Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
</ol>

海洋微生物は、その局所的な化学および物理的環境との対話方法を理解することは海洋の栄養と炭素循環（アザムとマルファッティ2007）におけるプランクトンの微生物の役割のより完全で正確な認識のために不可欠です。しかし、多くの重要な微生物の相互作用が行われる以上の小スケール（&lt;MM）のために、技術的な限界は、異種生物物理化学的風景の中で微生物の挙動の詳細な検査を妨げている海で泳いで微生物によって経験されると予測。マイクロフルイディクスの最近の進歩（ホワイトサイズら2001）（真央ら、2003、Parkら、2003、キーマーほか2006、マルコスとストッカー2006）複雑な微細環境内微生物生態学の詳細な分析を有効にしている。マイクロ流体デバイスは、私たちは、単一細胞レベルで、乱流せん断中に拡散する栄養パッチ（ブラックバーンら。1997年、1998年）と微生物の遊泳行動への海洋微生物の走化性応答の両方をチェックすることが許容さここで説明する。 マイクロ流体チャネルを作成するためには、ソフトリソグラフィ製造プロセスは、チャネル内の流れと勾配の正確な制御を可能にして、チャネルのアーキテクチャ内で作成される複雑な詳細を可能にする。製造技術によってもたらされる柔軟性は、比較研究...

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>シリコーンエラストマーキット</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>http://www.ellsworth.com/sylgard.html</td></tr><tr><td>SU8-2100</td><td>フォトレジスト</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>www.microchem.com</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E 倒立顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEEKチューブ (0.762 mm ID, 1.59 mm OD)</td><td>ツール</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>www.upchurch.com</td></tr><tr><td>シリンジ (Luer-Lokチップ)</td><td>ツール</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィッティングパーツ P-704-01</td><td>ツール</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>チューブをLuer-Lokチップシリンジに接続するため</td></tr><tr><td>シリンジポンプ (PHD 2000 プログラマブル)</td><td>装置</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ (PCO 1600)</td><td>装置</td><td>Cook</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

浮遊微生物は、マイクロリソースのパッチを利用できる程度は、海洋trophodynamicsと生物地球化学的フラックスにかなりの影響を持つことになります。しかし、海洋における栄養のパッチを利用するために、水泳の微生物は、パッチの可用性と、それらを検索する細菌の能力を制限する分子拡散と乱流せん断、を含む物理的な力の影響を克服する必要があります。最近まで、方法論的限界は、斑状の生息地と現実的な小さなスケールの流れの条件の中で微生物の挙動の直接検査を排除している。したがって、はるかに海の微生物の挙動に関する我々の現在の知識の多く​​は、理論的な予測から調達されています。我々は海洋プロセスに関連する寸法と拡散性の特性を持つ我々が作成するために使用されている2マイクロ流体デバイスは、（i）マイクロ栄養素のパッチを開発するためのソフトリソグラフィ加工技術を適用している海の微生物の餌行動に新しい情報を取得するには、および（ii）マイクロスケール海で予想されるものに相当するせん断速度と渦、。これらのマイクロ流体デバイスは、異種と動的な海の風景の中の微生物水泳と走化性行動の最初の直接検査を認めている。個々の微生物の遊泳行動に加えて、人口レベルの集合反応を観察しながら落射蛍光、位相差顕微鏡の併用は、物理的な寸法や栄養素のパッチの拡散特性の直接検査を可能にする。これらの実験は、植物プランクトン、従属栄養細菌とphagotrophic原生生物のいくつかの種が非常に短い時間枠内に拡散マイクロリソースのパッチを見つけて悪用することに熟達していることを明らかにした。我々はまた、せん断速度を緩和することを示している、海洋細菌は、自発的にその環境を経由して流れ、スイムを戦うことができます。しかし、しきい値高せん断レベルを超えて、細菌はせん断流れに整列し、フローからの外乱なし水泳の少ない能力がありますされています。マイクロフルイディクスは、水生微生物の生態を研究するための新規かつ安価なアプローチを表し、かつ正確にマイクロスケールでの現実的な流れ場と基板のグラデーションを作成するための適性のために、相互作用の最小スケールでの微生物の挙動の試験に理想的に適用可能です。そこで、マイクロフルイディクスは、海の微生物の生態の理解を得るための貴重なツールを表すことを示唆している。

マイクロ流体チャネルおよび斑状の栄養の海の風景とせん断流内細菌の遊泳行動の中で海洋微生物の化学走性採食行動を研究するための実験で、その実装の製造が記載されている。

プランクトン微生物がマイクロスケールの資源パッチをどの程度利用できるかは、海洋の栄養動態や……に大きな影響を及ぼすと考えられる。

こんにちは、マルコスです。私はMITの土木環境工学部でRoman Stalker教授と共に研究しており、今回はセルフフォトグラフィー技術を用いてマイクロチャネルを作製する方法をご紹介します。まず、マスクを設計する必要があります。これがマスクです。基本的には、作製しようとしているマイクロチャネルの最終設計図になります。これはインジェクターの設計で、栄養剤の薄層を作り、そこに微生物を泳がせて化学走性を観察できるようにしたものです。そしてこちらはサイドキャビティのチャネルで、キャビティ内にマイクロボルテックス（微細渦）を発生させるためのものです。これについては、後ほどビデオで紹介します。マスクを用意した後、ウェハーをクリーンルームに持ち込み、ペトリ皿の上に置きます。それでは、今からクリーンルームに向かいます。マスクの印刷が完了し準備が整いましたので、ここからはクリーンルームに入り、実際の微細加工を行います。まず、購入したばかりのクリーンウェハーを使用しますが、以下の3種類の溶媒を用いて極めて清潔な状態にします。最初のステップとして、アセトンで洗浄し、その後すぐにメタノールで洗浄します。そして、最後のステップはイソプロパノールです。コーティングの準備が整ったウェハーの光沢面で作業を行います。ここから、窒素を用いてエアドライさせます。ウェハーを乾燥させた後、約130 °Cのオーブンにウェハーを入れ、5〜10分間ベークします。ウェハーのベークを待つ間に、2台のホットプレートを準備し、一方を65 °Cに、もう一方を95 °Cに設定します。5分間のベーク後、ウェハーをオーブンから取り出し、室温で約5分間静置させます。これでスピンコートの準備が整いました。フォトレジストを塗布する前に、表面にダスト粒子が付着していないか確認する必要があります。窒素を使用してウェハの表面を吹き付けます。吹き付ける際は、中心から外側に向かって行います。これから、ウェハーの上にフォトレジストを注ぎます。約3 mLを注ぎ入れます。ウェハーにフォトレジストを注ぐ際、気泡が発生しないよう、ボトルをできるだけ低い位置に保持してください。次に、スピンコートを開始する前に、フォトレジストをウェハー上に1分ほど静置させます。前述の通り、コーティングの厚さを100 µmにするため、合計スピン時間を55秒に設定して、回転を開始します。まず、回転速度を0から500 RPMまで5秒かけて上げ、フォトレジストがウェハ全体に塗布されることを確認しながら約10秒間回転させます。その後、3000 RPMまで約7秒かけて加速させ、30秒間回転させます。ウェハにフォトレジストを塗布した後、ウェハをホットプレートの上に置き、65 °Cで5分間、次いで95 °Cで20分間のソフトベークを行います。95 °Cでのソフトベークが完了した後、

chemotactic-response-marine-micro-organisms-to-micro-scale-nutrient

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マイクロ流体を用いた細菌走化性の研究 - インタビュー

このプロトコルは、chemoeffectorsの安定した濃度勾配で細菌の走化性を調べるためのマイクロ流体デバイスの開発を説明します。...

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

ここでは、遠隔地の海洋環境における有機的および無機的な栄養素の利用可能性と、微生物およびウイルス群集の存在量と構造を評価するための包括的なプロトコルを提示します。...

水化学と海洋微生物学へのフィールドガイド - 海における幽玄選手の解明

ここで我々 は急性の機械的刺激に対する細胞応答を評価するための方法を説明します。顕微鏡ベースのアッセイでは、蛍光標識したバイオ センサー シアー流を含む簡単な刺激の局在を調べる。我々 はまた、生化学的急性の機械的刺激に対する応答の興味の様々...

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

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微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

ここで提示される、環境中の微生物行動の研究を直接可能にする最近開発されたマイクロ流体装置であるin situ...

水生生態系における微生物行動を調べるSitu chemotaxisアッセイで

私たちはミリ流体連続培養装置(MCCD)のプロトコルを提示します。これは、一定の低栄養素条件(数百ナノモル濃度まで)または時間的な栄養素変動を極短の時間スケールで培養することを可能にします。...

低栄養素および変動する栄養条件下での 大腸菌 研究のための連続培養ミリ流体装置

ジャレッドベターは、シロアリの後腸での生活の居住者の多様性を通じて、自然の散歩に私達を取る -...

共生の層 - シロアリ後腸の微生物コミュニティの可視化

細胞生物学のためのマイクロスケールのエンジニアリング

私たちは、環境のmRNAからcDNAを生成するための方法を提示する。一般的に、トータルRNAは、最初の環境から収集され、rRNAを選択的に除去され、mRNAが選択的に増幅され、濃縮mRNAのプールから合成したcDNAは、配列決定される。回収された配列は、発現遺伝子を識別するために、標準的なバイオインフォマティクス技術を用いて注釈を付けることができます。...

環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析

学ぶマイクロ流体デバイス製造と海洋微生物の走化性応答。マイクロチャンネルで栄養勾配を制御し、Dunaliella tertiolectaの餌探索行動と剪断流中の細菌遊泳を解析する手法を解説。生態学的役割の理解に貢献。

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

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