マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

マイクロ流体チャネルおよび斑状の栄養の海の風景とせん断流内細菌の遊泳行動の中で海洋微生物の化学走性採食行動を研究するための実験で、その実装の製造が記載されている。

こんにちは、私の名前はマルコスです。私はMITのCivil Environmental EngineeringのRoman Stalker教授と一緒に働いており、セルフフォトグラフィーの技術を使ってマイクロチャンネルの作り方をお見せします。そしてまず、マスクをデザインする必要があります。

これがマスクで、基本的には私たちがやろうとしているマイクロチャネルの最終設計です。これはインジェクターの設計ですので、その周りを微生物が泳いでいるところに栄養の薄い層を作ることができ、化学療法がどのように課税されるかを見ることができます、これは空洞内に微小な渦を生成するための側空洞のチャネルです。 ウエハースをクリーンルームに運び、ペトリ皿の上に入れます。そして、私たちは今、クリーンルーム

さて、マスクを印刷して準備が整った後、今度はクリーンルームで実際の微細加工を行います。そして、これからやろうとしていることは、買ったばかりのきれいなウエハースの一部を取り、次の木の溶剤を使用して、それがさらにきれいであることを確認したいだけです。最初のステップは、アセトンを使用して洗浄し、次にすぐにメタノールを使用して洗浄することです。

そして、最後のステップはイソプロパノールです。そして、コーティングのために準備されたウェーハの光沢のある側に取り組んでいます。そして今度は窒素を使ってブロードライします。

ウェーハを乾燥させた後、今度はウェーハを摂氏約130度のオーブンに入れ、5〜10分間焼きます。その間、ウェーハのベーキングを待っている間に、摂氏1 7 65度と摂氏1 95度の2つのホットプレートを準備できます。そこで、5分間焼いた後、オーブンからウエハースを取り出し、室温で約5分間

そして、スピンコーティングの準備が整います。フォトレジストを注ぐ前に、その上にほこりの粒子がないことを確認するだけで、窒素を使用してウェーハの上に噴出させる必要があります。潮吹きモーションは中心から外側に。

次に、このウェーハの上にフォトレジストを流し込みます。約3ミリリットルの量を注ぎます。フォトレジストをウェーハの上に注ぐときに泡が発生しないように、ボトルをできるだけ低く置いてください。

それでは、フォトレジストをウェーハ上に約1分間置いてから、回転を始めます。そして、先ほど述べたように、私は100ミクロンの厚さのコーティングをするつもりです。そこで、合計回転時間を55秒に設定して、回転を開始できます。

まず、回転速度を0回転から500回転まで5秒で上げ、フォトレジストがウェーハ全体をコーティングしているのがわかるように約10秒間回転させ、その後、約7秒間3000回転まで上昇させ、30秒間回転させようとします。そこで、フォトレジストでウェーハをコーティングした後、ホットプレートの上にウェーハを置き、摂氏65度で5分間、摂氏95度で20分間ソフトベークします。95°Cのソフトベーキングが終わったら、室温まで冷ましますが、その前に65°Cで2〜3分ほど冷やして、急激な温度低下を起こさないようにしています。

その後、室温で5分ほど冷まします。そして今度は紫外線を当てて、露光した部分が固まり、露光しなかった部分が後で洗い流されるようにします。これがマスクを使用する部分であり、ご覧のとおり、この設定では、マスクには透明な部分と完全に不透明または黒の部分の2つの部分があります。

そこで、このマスクをコーティングされたウェーハの上に置きます。つまり、印刷会社から入手するマスクには2つの側面があります。1つは、インクで印刷するものです。

そして、ウェーハに接触させたい部位です。次に、マスクを通してウェーハをUV光で露光します。そして、安全のために、この安全ゴーグルを着用します。

露光時間の長さは、使用しているSUAと、達成しようとしている厚さによって異なります。露光後、ウェーハを65度のホットプレートに置き、再度5分間、次に摂氏95度で20分間焼きます。そして、このベーキング時間は厚さの欲求から異なり、使用している方法も異なることを思い出してください。

この点に続いて、ウェーハを開発します。現像とは、フォトレジストの不要な部分を取り除き、露出した領域のみがウェーハ上に残るようにすることを意味します。ウェーハを現像し、フォトレジストの不要な部分を洗い流すために、現像剤を使用しています。

この場合、現像液として酢酸ポモナールを使用しており、このビーカーにこの溶剤を注ぎ、ウェーハを配置してビーカーに約10分間浸します。繰り返しになりますが、時間は厚さと使用している溶剤によって異なります。さて、10分後、このウェーハに残っているのは、必要なチャネルのデザインであり、不要な部分はすべて洗い流されてすすぎていることがわかります。

同じ溶剤、新しい溶剤、同じポリオンアセテートを使用し、ウェーハの上に噴出するだけで洗い流します。そして最後に、溶剤を洗い流すために、イソプロパノールを使用してすすぎます。そして今、私たちは窒素を使ってそれを吹き飛ばします。

そして今、あなたはそれに目的のパターンを持つきれいなウェーハを持っています。そして、私たちはこれをマスターと呼んでいます。今、私たちは研究室に戻ってPDMSを注ぎ、残りの手順を続けます。

さて、クリーンルームから戻ってきたところ、マスターを手に入れましたが、これは基本的にこの金型を何を行うかの金型です。次に行うことは、ポリマーであるPDMSを注ぎ、硬化させることです。ご覧の通り、この型の上にポリマーを流し込むと、ポリマーには何らかの溝ができ、最終的にはガラスライトに結合すると、そのポリマー自体がチャネルになります。

それでは、PDMSを準備します。これがPDMSであり、ポリマー、ポリダイルスローンPDMSです。そして、これが硬化剤です。

私がやろうとしていることは、この硬化剤をこのカップに注ぎ、このPDMSをこのカップに注ぎ、1対10の比率で混ぜることです。したがって、一般的には、均一に攪拌するためにforを使用したいと考えています。攪拌するとたくさんの泡が出てくるのですが、その泡は攪拌したかどうかの目印のようなものです。

さて、PDMSを硬化剤と混合した後、この混合物をウェーハであるマスターの上に注ぐ準備が整いました。そして、注ぐときにウェーハがどこにも行かないように、ウェーハをテープでテープで留めました。混合物PDMSをウェーハの上に注ぐ前に、ウェーハの上に落ちた可能性のあるほこりからウェーハをできるだけきれいにするように試みたいと思います。

そこで、コンプレッサーをオンにしてウェーハにほこりを払います。さて、PDMSにはたくさんのバブルがあることがわかります。そこで、これを真空チャンバーの中に入れて気泡を取り除きます。

そのため、掃除機をかけるには、すべての気泡を取り除くのに約30分かかります。そして、泡を取り除き終えたら、これを取り出して摂氏65度のオーブンに入れ、少なくとも12時間焼きます。そして、12時間後には、ウェーハを切断する準備が整います。

このナイフを使用してPDMSを切断し、PDMSをウェーハから取り出してから、このパンチャー全体を使用してチューブの入口と出口の穴を開けます。したがって、カットするときは、ナイフがウェーハに当たるまで置きますが、ウェーハを壊してチャネルの周りをカットしないように、圧力をかけすぎないようにします。次に、それを剥がします。

お持ちですか、これがチャネルであり、ウェーハからのパターンであることがわかりますか。だから、同じであることがわかります。そして今、このパターンは、このポリマー、このPDMSに刻

そして、これをガラスライトに結合すると、これが実験のチャネルになります。次のステップは、重要なことですが、マイクロチャネルに穴を開けた後、PDMSにマイクロチャネルに入口と出口を挿入できるように、穴を開けることを忘れないようにすることです。そこで、スコッチテープを使ってチャンネル側、つまり溝のあるところにテープで固定しました。

そして、このチャンネルをスコッチテープでテープで固定しているのは、すべてのほこりの粒子を取り除くためです。次のステップはプラズマボンディングです。そして、プラズマボンディングの前に、他のラボで行いますが、テープをはがして、接着したい表面、つまりこの表面とガラススライドを一緒に露出させ、それを酸素プラズマにさらし、その後、それらを一緒にして接着します。

こんにちは、私の名前はジャスティン・シーモアで、MITのローマンストッカーズラボのポスドク研究員です。私の研究は微生物生態学に焦点を当てており、より具体的には、海洋微生物がどのようにして海で食物を見つけることができるかを調べています。そして、マイクロ流体工学の技術を使用して、この種のパターンを調べています。

そこで、マーカスがプラズマ結合の前と後に生成する方法を示したチャネルを使用します。その後、これをマイクロ流体実験で自由に使用できます。この実験に先立って、実験で使用する基板を準備する必要があります。

そして、今日の実験では、海洋植物プランクトンのドネラ・トゥール・エレクトロがどのようにしてマイクロスケールの食物のパッチを見つけることができるかを見ていきます。この場合、それはアンモニウムであり、100マイクロモルのアンモニウム濃度を提供します。したがって、これらの実験では、食品に供給する栄養素の短所に蛍光染色を追加することで、食品のパッチを視覚化することができます。

そこで、フルオレセイン染料を使用しています。そこで、ここでは、最終濃度100マイクロモルのフルオレセインをアンモニウムにピペッティングし、これを栄養素として使用しています。そして、その栄養素を蛍光顕微鏡で可視化することで、栄養素の塊がどのように拡散するかを調べ、その栄養素の塊に対する生物の反応を調べることができます。

そのため、マイクロ流体工学の実験では、ガラス製の注射器を使用します。ですから、最初にやりたいことは、使用する注射器に基質と生物を追加することです。次のステップは、チューブをマイクロ流体セットアップに挿入することです。

そして、これを顕微鏡の段階で繰り返します。そこで、マイクロ流体チャネルを顕微鏡ステージに配置し、チューブを入口と出口に挿入します。次に、廃棄物リザーバーを挿入し、リザーバーが液体で半分満たされ、廃棄物リザーバーのチューブが完全に水没

これにより、チャネル内の圧力を一定に保つことができます。次に、生物(この場合はドネラ、レクター)、および栄養基質(この場合はアンモニウム)を含むマイクロ流体チャネルに供給するチューブに注射器を取り付けます。次に、顕微鏡をセットアップし、実験を開始する前に適切な位置にあるマイクロ流体チャネルを確認します。

チャンネルが所定の位置に配置されたら、カメラでチャンネルを表示するように切り替えて、コンピューターで視覚化できます。ピントを合わせてより細かい調整ができるようになり、栄養素を注入するインジェクターを視覚化できるようになりました。そして、これはマイクロ流体チャネルに組み込まれた100マイクロメートルのワイヤードニードルチップで構成されています。

そして、それらを注入することで栄養素の勾配を作り出すことができます。実験を開始する前に、この時点から、マイクロ流体システムに入った可能性のある気泡を取り除く必要があります。そして、この場合、人工海水で満たされた注射器を使用してこれを行いますが、これはバルブを介してマイクロ流体チャネルに取り付けることができます。

そして、このシリンジを押して、チャネルから気泡を取り除きます。気泡は、シリンジが生成する圧力によって出口から気泡を強制的に排出するか、ガスを透過するPDMS材料の壁に気泡を押し込むことによって除去する方法の2つのいずれかで除去できます。気泡が除去され、実験を開始する準備ができたら、シリンジポンプを使用して、チャネルへの注入と材料に適切な流量を設定します。

この場合、毎分2マイクロリットルの流量を使用しますが、これは毎秒266マイクロメートルのチャネル内の流量に相当します。適切な流量を設定したら、実験を開始することができます。これにより、細い栄養素の帯ができる流れが始まります。そのため、注入ポイントからチャネルに注入される栄養素を、栄養素にフルオレセイン色素を添加し、APF蛍光顕微鏡で可視化することで可視化し、マイクロ流体チャネルの流れを止めてパッチダイナミクスを観察することができます。

次に、位相差顕微鏡に切り替えて、チャネル内を泳ぐ生物を視覚化し、栄養パッチに対するそれらの位置を確認します。これは、毎秒10のフレームレートで一連のフレームを取得することで可能になり、これらの生物を視覚化できるムービーが生成されます。次に、1つのフレームが前のフレームから差し引かれた2つの個々のフレーム間の時間差を取ることで、泳いでいる生物を視覚化できます。

そのため、画像からバックグラウンドノイズを除去できます。その後、栄養パッチの最初のリリース後10〜20分間、一定の間隔で動画を録画します。また、画像解析ソフトウェアを使用して、シーケンス内の1つのフレームから別のフレームに生物の位置を重ね合わせることで、これらの生物の位置の変化を見て、遊泳軌跡に関する情報を取得し、そこから速度や方向の変化などの遊泳統計に関するより詳細な情報を得ることができます。

したがって、これらの実験により、海洋微生物がミクロスケールの栄養パッチを見つけて利用する方法を初めて直接調査することができました。これは、海洋の栄養動態と栄養循環に重要な影響を与える可能性があります。ですから、ジャスティンが述べたことに続いて、微生物、特にバクテリアが海で食物とどのように相互作用するかは、生化学サイクルに多くの影響を与える可能性があります。

しかし、海は鋼鉄であり、対処されておらず、風や表面によって発生する乱流など、多くの流れ条件があります。そして、微生物のスケールでは、彼らが観察しているもの、彼らが経験していることは、実際には大きな乱流ではなく、乱流の純粋な最小の残骸であり、クーググラフエディとして知られています。そして、私たちがここでやろうとしていることは、どのように、何を研究したいのか、このエディが微生物の想定行動にどのような影響を与える

そのために、先ほどお見せしたこの質量を使って、別のチャンネルを作っています。そして、中央に空洞があります。そして、図を拡大するために描かせてください。

これがチャネルのように見えますが、これは上から見たビューで、左から右に流れを注入し、せん断により、この空洞内に再循環領域を生成します。そして、この空洞は、グラフのアディスの表現です。ジャスティンがすでに説明したのと同じ設定を、シリンジポンプがオフになっているときに使用することができ、私はフローをオンにしませんでした、バクテリアがこの空洞内をほぼランダムに幸せに泳いでいることがわかります。

また、好ましい向きはありません。そして、あなたが見ている映画は時差映画で、ジャスティンが使っているのと全く同じ手法です。ですから、流れが非常に速いとき、ご覧の通り、バクテリアは渦によって遠ざかっています。

そして、バクテリア自体の軌跡は渦の流れに沿っています。そして、実際にはもっと興味深いのは、シリンジポンプをオンにすると次のようになります。しかし、速度はそれほど速くありません。

バクテリアがそれと戦うことができないのは速すぎることはありません。しかし、ある意味では、この映画にはまだ渦の類似性が見られます。この実験から、非常に強力で乱流のバクテリアがいると、流れに翻弄されてしまうと、流れに逆らうことができないことがわかりました。

しかし、穏やかな乱気流の地域では、彼らはまだ自発的に泳ぐことができます。