Name: マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 38 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイス製造と海洋微生物の走化性応答。マイクロチャンネルで栄養勾配を制御し、Dunaliella tertiolectaの餌探索行動と剪断流中の細菌遊泳を解析する手法を解説。生態学的役割の理解に貢献。

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私たちは、クリーンルーム施設内のこのビデオのフィルムの部分に私たちを可能にするため、MITのマイクロ技術研究所に感謝したいと思います。

準備 1。マスクを作成する<blockquote> CADソフトウェアを使用して、透明で高解像度印刷用のチャネルを設計する。これは、&quot;マスク&quot;になります。 </blockquote>クリーンルーム内で： 2。ウェハをクリーニングして焼くアセトンと、その後すぐにメタノールで、その後、イソプロパノールで最初に、噴出ウェハ。最後に、窒素を用いてウェハを乾燥させる。 5分間、オーブン（130℃）でウエハを焼く。 3。コー​​ティングウェハースピンコーティングマシンの中心にウェハを置きます。ウェハ上に瓶から注ぐフォトレジスト（SU - 8）。 SU - 8の流れを聞かせて〜10秒間リラックススピンコーターをオンにして、5秒かけて0から500 rpmにその速度を増加させる、10秒間、500rpmで維持、10秒以上の最終的な速度まで上昇し、30秒のために最終的な速度で維持する最終速度は、使用されるターゲットコーティングの厚さとSU - 8によります。詳細はで見ることができます<a href="http://www.microchem.com/">http://www.microchem.com/</a> 4。ソフトベークコー​​ティング後のウェーハは、° C、その後95℃65℃最初にそれを焼く℃に焼成時間は、ターゲットの厚さと使用されるフ​​ォトレジストの種類によって異なります。その後、ウェーハは、少なくとも5分間室温で放置します。 5。露出ウェハの上にマスクを配置し、SU - 8のマニュアルで推奨されている時間のために紫外線にウェハを公開。 6。露光後ベーク 65でウエハを焼くその後° Cおよび95 ° C以下のSU - 8のマニュアルの指示に従ってください。 7。 &quot;マスター&quot;（金型）を取得するためにウェーハを開発開発者（PMMA）で満たされたビーカーを準備します。フォトレジストの未露光部分は洗い流されるまで、非常に静かにビーカーを発振しながらビーカーにウェハを浸し。 私たちの研究室で： 8。 PDMSを準備して、ウェハ上に注ぐカップに10:1の比では硬化剤とPDMSを混ぜる。かき混ぜ、それが均質に混合する：これは、気泡をたくさん生成し、混合物が不透明に見えるようになります。 &quot;マスター&quot;の混合物を注ぐ。 9。真空チャンバー内の脱泡気泡を除去するため、すべての泡がなくなるまで真空チャンバ内にそれをカバーしているマスターとPDMS混合物を置く。 10。オーブンでベーキング 65℃硬化PDMSのオーブンで少なくとも12時間焼く。 11。パンチ穴チャンネルのインレットとアウトレットのためのマスターとパンチ穴からPDMS剥離。 クリーンルーム内（図示せず） 12。プラズマボンディングチャネルは、PDMS層と1分間の酸素プラズマによるガラスのスライドの両方を処理した後、スライドガラスに接着されている。 実験： EXP＃1：マイクロスケールの栄養素層への海洋微生物の走化性応答の調査 1）実験のセットアップ<ol><li>ガラスシリンジに生物と基板を追加します。 </li><li>顕微鏡ステージ上にマイクロ流体チャネルを置き、適切なインレットとアウトレットにチューブを取り付け</li><li>貯水池を無駄にチューブを接続します。チューブが完全に圧力の振動を避けるために、廃液溜めに流体に浸漬されていることを確認します</li><li>シリンジポンプにシリンジを配置し、バルブとチューブに接続</li><li>光条件、倍率等：顕微鏡を設定する</li><li>チャンネル内の適切な位置に焦点を当てる</li><li>人工海水で満たされた大きな注射器を使用してデバブルチャネル</li><li>シリンジポンプの適切な流量を設定します。この場合のチャネルで220μmのs -1の平均流速に対応し2ml /分、 </li></ol> 2）実験の実行<ol><li>チャンネル内の栄養勾配を確立するためにシリンジポンプを起動します。 </li><li>流れが安定していると栄養素のバンドが開発されると、シリンジポンプにフローを停止し、この時点から時間の録音を開始</li><li>栄養バンドは、横方向に拡散し始めます</li><li>定期的な時間間隔で、&quot;ムービー&quot;を作成するフレームのシーケンスを記録するために画像解析ソフトウェアを使用</li><li>私たちは動いていない粒子とバックグラウンドノイズから運動性の細胞を区別できるように、これだけ移動するオブジェクトが現在可視であることを、2つの後続のフレーム間の時間差画像を取ることによって泳ぐ生物を区別する</li><li> Pへの参照を使用して、チャネル内のセルの位置を決定するために映画を取る栄養パッチのosition </li><li> 10-20分のための定期的な間隔で記録映画は、位置と生物の遊泳パターンを分析する</li><li>別のフレーム（各ピクセルに映画の期間にわたってそのピクセルで記録された最大光強度を割り当てる）で生物の位置を重ね合わせ画像解析ソフトを使用することにより、我々は、水泳の細胞のための軌道情報を取得することができます</li></ol> EXP＃2：vortexZで泳いでいる海洋細菌に対する剪断の影響を調査<ol><li>別のチャネル形状を使用して、我々は異なるせん断速度でボルテックスで泳いで細菌の挙動を観察することができます</li></ol>

<ol><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+explicit+simulations+of+a+microbial+food+web.+%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Spatially explicit simulations of a microbial food web. </a> Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+plankton+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282, 2254-2256 (1998).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).</li>
<li>Marcos,, Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+in+vortices%3A+a+microfluidic+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Microorganisms in vortices: a microfluidic setup.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).</li>
<li>Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
</ol>

海洋微生物は、その局所的な化学および物理的環境との対話方法を理解することは海洋の栄養と炭素循環（アザムとマルファッティ2007）におけるプランクトンの微生物の役割のより完全で正確な認識のために不可欠です。しかし、多くの重要な微生物の相互作用が行われる以上の小スケール（&lt;MM）のために、技術的な限界は、異種生物物理化学的風景の中で微生物の挙動の詳細な検査を妨げている海で泳いで微生物によって経験されると予測。マイクロフルイディクスの最近の進歩（ホワイトサイズら2001）（真央ら、2003、Parkら、2003、キーマーほか2006、マルコスとストッカー2006）複雑な微細環境内微生物生態学の詳細な分析を有効にしている。マイクロ流体デバイスは、私たちは、単一細胞レベルで、乱流せん断中に拡散する栄養パッチ（ブラックバーンら。1997年、1998年）と微生物の遊泳行動への海洋微生物の走化性応答の両方をチェックすることが許容さここで説明する。 マイクロ流体チャネルを作成するためには、ソフトリソグラフィ製造プロセスは、チャネル内の流れと勾配の正確な制御を可能にして、チャネルのアーキテクチャ内で作成される複雑な詳細を可能にする。製造技術によってもたらされる柔軟性は、比較研究...

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>シリコーンエラストマーキット</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>http://www.ellsworth.com/sylgard.html</td></tr><tr><td>SU8-2100</td><td>フォトレジスト</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>www.microchem.com</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E 倒立顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEEKチューブ (0.762 mm ID, 1.59 mm OD)</td><td>ツール</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>www.upchurch.com</td></tr><tr><td>シリンジ (Luer-Lokチップ)</td><td>ツール</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィッティングパーツ P-704-01</td><td>ツール</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>チューブをLuer-Lokチップシリンジに接続するため</td></tr><tr><td>シリンジポンプ (PHD 2000 プログラマブル)</td><td>装置</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDカメラ (PCO 1600)</td><td>装置</td><td>Cook</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

浮遊微生物は、マイクロリソースのパッチを利用できる程度は、海洋trophodynamicsと生物地球化学的フラックスにかなりの影響を持つことになります。しかし、海洋における栄養のパッチを利用するために、水泳の微生物は、パッチの可用性と、それらを検索する細菌の能力を制限する分子拡散と乱流せん断、を含む物理的な力の影響を克服する必要があります。最近まで、方法論的限界は、斑状の生息地と現実的な小さなスケールの流れの条件の中で微生物の挙動の直接検査を排除している。したがって、はるかに海の微生物の挙動に関する我々の現在の知識の多く​​は、理論的な予測から調達されています。我々は海洋プロセスに関連する寸法と拡散性の特性を持つ我々が作成するために使用されている2マイクロ流体デバイスは、（i）マイクロ栄養素のパッチを開発するためのソフトリソグラフィ加工技術を適用している海の微生物の餌行動に新しい情報を取得するには、および（ii）マイクロスケール海で予想されるものに相当するせん断速度と渦、。これらのマイクロ流体デバイスは、異種と動的な海の風景の中の微生物水泳と走化性行動の最初の直接検査を認めている。個々の微生物の遊泳行動に加えて、人口レベルの集合反応を観察しながら落射蛍光、位相差顕微鏡の併用は、物理的な寸法や栄養素のパッチの拡散特性の直接検査を可能にする。これらの実験は、植物プランクトン、従属栄養細菌とphagotrophic原生生物のいくつかの種が非常に短い時間枠内に拡散マイクロリソースのパッチを見つけて悪用することに熟達していることを明らかにした。我々はまた、せん断速度を緩和することを示している、海洋細菌は、自発的にその環境を経由して流れ、スイムを戦うことができます。しかし、しきい値高せん断レベルを超えて、細菌はせん断流れに整列し、フローからの外乱なし水泳の少ない能力がありますされています。マイクロフルイディクスは、水生微生物の生態を研究するための新規かつ安価なアプローチを表し、かつ正確にマイクロスケールでの現実的な流れ場と基板のグラデーションを作成するための適性のために、相互作用の最小スケールでの微生物の挙動の試験に理想的に適用可能です。そこで、マイクロフルイディクスは、海の微生物の生態の理解を得るための貴重なツールを表すことを示唆している。

マイクロ流体チャネルおよび斑状の栄養の海の風景とせん断流内細菌の遊泳行動の中で海洋微生物の化学走性採食行動を研究するための実験で、その実装の製造が記載されている。

プランクトン微生物がマイクロスケールの資源パッチをどの程度利用できるかは、海洋の栄養動態や……に大きな影響を及ぼすと考えられる。

こんにちは、マルコスです。私はMITの土木環境工学部でRoman Stalker教授と共に研究しており、今回はセルフフォトグラフィー技術を用いてマイクロチャネルを作製する方法をご紹介します。まず、マスクを設計する必要があります。これがマスクです。基本的には、作製しようとしているマイクロチャネルの最終設計図になります。これはインジェクターの設計で、栄養剤の薄層を作り、そこに微生物を泳がせて化学走性を観察できるようにしたものです。そしてこちらはサイドキャビティのチャネルで、キャビティ内にマイクロボルテックス（微細渦）を発生させるためのものです。これについては、後ほどビデオで紹介します。マスクを用意した後、ウェハーをクリーンルームに持ち込み、ペトリ皿の上に置きます。それでは、今からクリーンルームに向かいます。マスクの印刷が完了し準備が整いましたので、ここからはクリーンルームに入り、実際の微細加工を行います。まず、購入したばかりのクリーンウェハーを使用しますが、以下の3種類の溶媒を用いて極めて清潔な状態にします。最初のステップとして、アセトンで洗浄し、その後すぐにメタノールで洗浄します。そして、最後のステップはイソプロパノールです。コーティングの準備が整ったウェハーの光沢面で作業を行います。ここから、窒素を用いてエアドライさせます。ウェハーを乾燥させた後、約130 °Cのオーブンにウェハーを入れ、5〜10分間ベークします。ウェハーのベークを待つ間に、2台のホットプレートを準備し、一方を65 °Cに、もう一方を95 °Cに設定します。5分間のベーク後、ウェハーをオーブンから取り出し、室温で約5分間静置させます。これでスピンコートの準備が整いました。フォトレジストを塗布する前に、表面にダスト粒子が付着していないか確認する必要があります。窒素を使用してウェハの表面を吹き付けます。吹き付ける際は、中心から外側に向かって行います。これから、ウェハーの上にフォトレジストを注ぎます。約3 mLを注ぎ入れます。ウェハーにフォトレジストを注ぐ際、気泡が発生しないよう、ボトルをできるだけ低い位置に保持してください。次に、スピンコートを開始する前に、フォトレジストをウェハー上に1分ほど静置させます。前述の通り、コーティングの厚さを100 µmにするため、合計スピン時間を55秒に設定して、回転を開始します。まず、回転速度を0から500 RPMまで5秒かけて上げ、フォトレジストがウェハ全体に塗布されることを確認しながら約10秒間回転させます。その後、3000 RPMまで約7秒かけて加速させ、30秒間回転させます。ウェハにフォトレジストを塗布した後、ウェハをホットプレートの上に置き、65 °Cで5分間、次いで95 °Cで20分間のソフトベークを行います。95 °Cでのソフトベークが完了した後、室温まで冷却しますが、急激な温度低下を防ぐため、その前に65 °Cで約2〜3分間戻し冷却を行います。その後、室温で約5分間冷却します。次に、UV光を照射します。これにより、露光された部分は硬化し、非露光部分は後で洗浄して除去されます。ここでマスクを使用しますが、ご覧のように、この設定ではマスクは透明な部分と、完全に不透明（この場合は黒色）な部分の2つの領域で構成されています。次に、このマスクをコートしたウェハの上に配置します。印刷会社から届くマスクには2つの面があり、一方にインクで印刷されています。そして、ここがウェハーと接触させる部位になります。これから、マスクを通してUV光でウェハーを露光します。安全のため、この保護ゴーグルを着用します。露光時間は、使用するSUAおよび達成しようとする膜厚によって異なります。露光後、ウェハを65 °Cのホットプレートに載せて5分間ベークし、次に95 °Cで20分間ベークします。なお、このベーク時間は、希望する膜厚や使用するSUAによって異なることに注意してください。次に、ウェハーを現像します。現像とは、不要なフォトレジスト部分を除去し、露光された領域のみをウェハー上に残す操作のことです。ウェハーを現像し、不要なフォトレジストを洗い流すために、現像液を使用します。このケースでは、現像液としてポモナール酢酸を使用します。この溶媒をビーカーに注ぎ、ウェハーを配置して、約10分間ビーカーに浸漬させます。なお、時間は膜厚や使用する溶媒によって異なります。10分後、ウェハー上に目的のチャネル設計のみが残り、不要な部分はすべて洗浄されて除去されたことが確認できます。最後にすすぎを行います。新しい同じ溶媒と、同じポリオン酢酸を使用し、ウェハーの上に噴射して洗浄します。最後に、溶媒を洗い流すためにイソプロパノールでリンスします。その後、窒素を用いてブロードライします。これで、目的のパターンが形成されたクリーンなウェハーが完成しました。これをマスターと呼びます。それでは研究室に戻り、これにPDMSを流し込み、残りの手順を継続します。クリーンルームから戻り、これから使用するモールドとなるマスターを入手しました。次に、ポリマーであるPDMSを流し込み、硬化させます。このようにモールドの上にポリマーを流し込むことで、ポリマーに溝が形成され、最終的にこれをガラススライドに接合することで、ポリマー自体がチャネルとなります。それでは、PDMSを調製します。こちらがポリマーであるポリジメチルシロキサン（PDMS）で、こちらが硬化剤です。硬化剤をカップに注ぎ、そこにPDMSを1:10の比率で加えて混合します。通常、均質に混ぜるために攪拌棒を使用します。攪拌すると多くの気泡が発生しますが、この気泡は十分に攪拌されたかどうかの目安となります。PDMSと硬化剤を混合した後、ウェハーであるマスターの上にこの混合液を流し込みます。流し込みの際にウェハーが動かないように、テープで固定しています。ウェハーの上にPDMS混合液を流し込む前に、表面に付着している可能性のあるホコリを可能な限り取り除き、ウェハーを清潔な状態にします。コンプレッサーを起動してウェハーの除塵を行います。さて、PDMSに多くの気泡があることがわかります。そこで、これを真空チャンバーに入れることで気泡を除去します。真空脱泡には、すべての気泡を除去するのに概ね30分かかります。気泡の除去が完了したら、これを取り出して65 °Cのオーブンに入れ、少なくとも12時間焼き付けます。12時間後には、ウェハーを切断できる状態になります。このナイフを使用してPDMSを切り、ウェハーからPDMSを取り出します。次に、このホールパンチを使用して、チューブの入口と出口のための穴を開けます。切断する際は、ナイフがウェハーに触れるまで切り込みを入れますが、ウェハーを破損させないよう、過剰な圧力をかけずにチャンネルの周囲を切ってください。準備ができたら、剥がし取ります。ご覧の通り、これがウェハーのパターンから転写されたチャネルです。したがって、両者が同一であることがわかります。そして現在、このパターンがこのポリマーであるPDMSに刻印されています。これをガラススライドに接合させると、これが実験用のチャネルになります。次の重要なステップは、PDMSのマイクロチャネルに穴を開け、インレット（入口）とアウトレット（出口）を挿入できるようにすることです。ここでは、溝があるチャネル側にスコッチテープを貼り付けて固定しました。このチャネルをセロハンテープで貼り付ける理由は、すべての塵粒子を除去するためです。次のステップはプラズマボンディングです。別のラボで行うプラズマボンディングの前に、テープを剥がして接合したい面、つまりこの面とガラススライドを露出させ、それらを酸素プラズマにさらします。その後、それらを合わせると接合されます。こんにちは。私はジャスティン・セイモアです。MITのローマン・ストッカー研究室で博士研究員として活動しています。私の研究は微生物生態学に焦点を当てており、より具体的には、海洋微生物が海洋中の餌のパッチをどのようにして見つけることができるかについて研究しています。私たちは、こうしたパターンの解析にマイクロフルイディクス技術を用いています。ここでは、先にマーカスが作製方法を実演した、プラズマボンディング後のチャネルを使用します。これにより、マイクロフルイディクス実験への適用が可能になります。本実験に先立ち、使用する基板の準備を行う必要があります。本日の実験では、海洋植物プランクトンの Donella turcica がどのようにしてマイクロスケールの餌のパッチを見つけることができるかについて検討します。今回の餌はアンモニウムであり、100 µM 濃度のアンモニウムを供給します。これらの実験では、提供する栄養素に蛍光染料を添加することで、餌のパッチを可視化することができます。そこでフルオレセイン染料を使用します。ここでは、栄養剤として使用するアンモニウムに、最終濃度 100 µM となるようにフルオレセインをピペッティングしています。これにより、蛍光顕微鏡下でこの栄養剤を可視化することができ、栄養剤のパッチがどのように拡散していくか、そしてその栄養剤パッチに対する生物の反応を観察することが可能になります。マイクロフルイディクス実験では、ガラス製シリンジを使用します。まず、使用するシリンジに基質と生物を添加します。次に、チューブをマイクロフルイディクス装置に挿入します。この操作は顕微鏡ステージ上で行います。マイクロ流路チャンネルを顕微鏡ステージに設置し、入口と出口にチューブを挿入します。次に廃棄液リザーバーを設置し、リザーバー内のチューブが完全に浸るように、液を満たして半分まで充填します。これにより、チャネル内の圧力を一定に保つことができます。次に、生物（本ケースではdonella、lector）と栄養基質（本ケースではammonium）を含むマイクロフルイディクスチャネルに供給するチューブにシリンジを装着します。その後、顕微鏡をセットアップし、実験を開始する前にマイクロフルイディクスチャネルが適切な位置にあるかを確認します。チャンネルが定位置に配置されたら、カメラに切り替えてチャンネルを確認し、コンピュータ上で可視化します。これで、フォーカスのより微細な調整が可能になり、栄養剤を注入するためのインジェクターを視認できます。このインジェクターは、マイクロ流路チャンネルに組み込まれた 100 µm の有線針先で構成されています。栄養素を注入することで、濃度勾配を形成させることができます。実験を開始する前のこの段階で、マイクロ流路系内に混入した気泡をすべて除去する必要があります。ここでは、人工海水を満たしたシリンジを使用し、バルブを介してマイクロ流路チャネルに接続して気泡の除去を行います。次に、このシリンジを押し、チャネル内から気泡を除去します。気泡の除去には2つの方法があります。シリンジによって生じた圧力で気泡をアウトレットから強制的に排出する方法と、ガス透過性を持つPDMS材料の壁面を通して気泡を排出させる方法です。気泡が除去され、実験の準備が整ったら、シリンジポンプを用いて、チャネルへの注入液および材料の適切な流速を設定します。本ケースでは、流速を2 µL/minに設定しています。これはチャネル内の流速に換算すると266 µm/sに相当します。適切な流速を設定した後、フローを開始して実験を始めると、栄養分の薄いバンドが形成されます。栄養分にフルオレセイン色素を添加し、APF蛍光顕微鏡下で観察することで、注入点からチャネル内に注入される栄養分を可視化できます。その後、マイクロ流路チャネルのフローを停止させ、元の位置から側方に拡散した栄養分のバンドを可視化することで、パッチダイナミクスを観察することが可能です。次に、位相差顕微鏡に切り替えて、チャネル内を泳ぐ生物を視覚化し、栄養塩パッチに対するそれらの位置を確認します。1秒間に10フレームのフレームレートで一連のフレームを撮影することで、これらの生物を視覚化できる動画を作成します。さらに、あるフレームから直前のフレームを差し引くという2つの個別のフレーム間の時間差を取ることで、移動している物体のみを視覚化し、泳いでいる生物を確認することができます。これにより、画像から背景ノイズを除去することができます。次に、栄養パッチを最初に放出した後、10分から20分間、一定の間隔で動画を記録します。画像解析ソフトウェアを用いて、シーケンス内のあるフレームから別のフレームへ生物の位置を重ね合わせることで、これらの生物の位置変化を観察し、遊泳軌跡に関する情報を得ることができます。そこから、速度や方向転換を含む、遊泳統計に関するより詳細な情報を得ることが可能です。これらの実験により、海洋微生物がどのようにしてマイクロスケールの栄養塩パッチを発見し、それを利用できるのかを初めて直接的に検証することができました。これは、海洋における栄養段階のダイナミクスや栄養塩サイクルにとって重要な意味を持つ可能性があります。ジャスティンが述べたことに続き、微生物、特に細菌が海洋中でどのように餌と相互作用するかが、生物地球化学的サイクルに多くの影響を及ぼすと考えられます。しかしながら、海洋は決して静止しているわけではなく、風や海面によって生成される乱流など、多くの流れの状態が存在します。微生物のスケールにおいて、彼らが実際に経験しているのは大規模な乱流ではなく、せん断力や、乱流の最小の残滓であるコールグラフ・エディ（Kolmogorov eddy）と呼ばれるものです。本研究で私たちが取り組もうとしているのは、このエディが微生物の遊泳行動にどのような影響を与えるかを解明することです。そして、そのために、先ほどお見せしたこの質量を用いて別のチャネルを作成します。中心には空洞があります。図を大きくするために描き足しましょう。これがチャネルの外観です。これは上から見た図で、左から右へ流れを注入します。せん断力により、このキャビティ内部に再循環領域が生成されます。このキャビティは、グラフトの Addis を再現したものです。先ほど Justin が説明したセットアップをそのまま使用できます。シリンジポンプをオフにし、流れを全く出していない状態では、細菌がこのキャビティ内でほぼランダムに、活発に泳いでいるのがわかります。また、優先的な配向は見られません。そして、現在ご覧いただいている動画は時間差（タイムディファレンス）動画であり、これはジャスティンが使用しているものと全く同じ手法です。ご覧の通り、流れが非常に速いとき、細菌は渦によって押し流されています。そして、細菌自体の軌跡は渦の流線に従います。さらに興味深いのは、シリンジポンプを起動させた後の挙動です。ただし、速度はそれほど速くありません。細菌が対抗できないほど速すぎるということはありません。しかし、ある意味では、この動画の中で渦のような様子をはっきりと確認できます。したがって、この実験から、非常に強い乱流が存在する場合、細菌は流れに翻弄され、流れに対抗することはできないということが分かりました。しかしながら、緩やかな乱流領域において、彼らは依然として自力で泳ぐことができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

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