マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

こんにちは、マルコスです。私はMITの土木環境工学部でRoman Stalker教授と共に研究しており、今回はセルフフォトグラフィー技術を用いてマイクロチャネルを作製する方法をご紹介します。まず、マスクを設計する必要があります。

これがマスクです。基本的には、作製しようとしているマイクロチャネルの最終設計図になります。これはインジェクターの設計で、栄養剤の薄層を作り、そこに微生物を泳がせて化学走性を観察できるようにしたものです。そしてこちらはサイドキャビティのチャネルで、キャビティ内にマイクロボルテックス（微細渦）を発生させるためのものです。これについては、後ほどビデオで紹介します。マスクを用意した後、ウェハーをクリーンルームに持ち込み、ペトリ皿の上に置きます。それでは、今からクリーンルームに向かいます。

マスクの印刷が完了し準備が整いましたので、ここからはクリーンルームに入り、実際の微細加工を行います。まず、購入したばかりのクリーンウェハーを使用しますが、以下の3種類の溶媒を用いて極めて清潔な状態にします。最初のステップとして、アセトンで洗浄し、その後すぐにメタノールで洗浄します。

そして、最後のステップはイソプロパノールです。コーティングの準備が整ったウェハーの光沢面で作業を行います。ここから、窒素を用いてエアドライさせます。

ウェハーを乾燥させた後、約130 °Cのオーブンにウェハーを入れ、5〜10分間ベークします。ウェハーのベークを待つ間に、2台のホットプレートを準備し、一方を65 °Cに、もう一方を95 °Cに設定します。5分間のベーク後、ウェハーをオーブンから取り出し、室温で約5分間静置させます。

これでスピンコートの準備が整いました。フォトレジストを塗布する前に、表面にダスト粒子が付着していないか確認する必要があります。窒素を使用してウェハの表面を吹き付けます。吹き付ける際は、中心から外側に向かって行います。

これから、ウェハーの上にフォトレジストを注ぎます。約3 mLを注ぎ入れます。ウェハーにフォトレジストを注ぐ際、気泡が発生しないよう、ボトルをできるだけ低い位置に保持してください。

次に、スピンコートを開始する前に、フォトレジストをウェハー上に1分ほど静置させます。前述の通り、コーティングの厚さを100 µmにするため、合計スピン時間を55秒に設定して、回転を開始します。

まず、回転速度を0から500 RPMまで5秒かけて上げ、フォトレジストがウェハ全体に塗布されることを確認しながら約10秒間回転させます。その後、3000 RPMまで約7秒かけて加速させ、30秒間回転させます。ウェハにフォトレジストを塗布した後、ウェハをホットプレートの上に置き、65 °Cで5分間、次いで95 °Cで20分間のソフトベークを行います。95 °Cでのソフトベークが完了した後、室温まで冷却しますが、急激な温度低下を防ぐため、その前に65 °Cで約2〜3分間戻し冷却を行います。

その後、室温で約5分間冷却します。次に、UV光を照射します。これにより、露光された部分は硬化し、非露光部分は後で洗浄して除去されます。ここでマスクを使用しますが、ご覧のように、この設定ではマスクは透明な部分と、完全に不透明（この場合は黒色）な部分の2つの領域で構成されています。

次に、このマスクをコートしたウェハの上に配置します。印刷会社から届くマスクには2つの面があり、一方にインクで印刷されています。

そして、ここがウェハーと接触させる部位になります。これから、マスクを通してUV光でウェハーを露光します。安全のため、この保護ゴーグルを着用します。

露光時間は、使用するSUAおよび達成しようとする膜厚によって異なります。露光後、ウェハを65 °Cのホットプレートに載せて5分間ベークし、次に95 °Cで20分間ベークします。なお、このベーク時間は、希望する膜厚や使用するSUAによって異なることに注意してください。

次に、ウェハーを現像します。現像とは、不要なフォトレジスト部分を除去し、露光された領域のみをウェハー上に残す操作のことです。ウェハーを現像し、不要なフォトレジストを洗い流すために、現像液を使用します。

このケースでは、現像液としてポモナール酢酸を使用します。この溶媒をビーカーに注ぎ、ウェハーを配置して、約10分間ビーカーに浸漬させます。なお、時間は膜厚や使用する溶媒によって異なります。10分後、ウェハー上に目的のチャネル設計のみが残り、不要な部分はすべて洗浄されて除去されたことが確認できます。最後にすすぎを行います。

新しい同じ溶媒と、同じポリオン酢酸を使用し、ウェハーの上に噴射して洗浄します。最後に、溶媒を洗い流すためにイソプロパノールでリンスします。その後、窒素を用いてブロードライします。

これで、目的のパターンが形成されたクリーンなウェハーが完成しました。これをマスターと呼びます。それでは研究室に戻り、これにPDMSを流し込み、残りの手順を継続します。

クリーンルームから戻り、これから使用するモールドとなるマスターを入手しました。次に、ポリマーであるPDMSを流し込み、硬化させます。このようにモールドの上にポリマーを流し込むことで、ポリマーに溝が形成され、最終的にこれをガラススライドに接合することで、ポリマー自体がチャネルとなります。

それでは、PDMSを調製します。こちらがポリマーであるポリジメチルシロキサン（PDMS）で、こちらが硬化剤です。

硬化剤をカップに注ぎ、そこにPDMSを1:10の比率で加えて混合します。通常、均質に混ぜるために攪拌棒を使用します。攪拌すると多くの気泡が発生しますが、この気泡は十分に攪拌されたかどうかの目安となります。

PDMSと硬化剤を混合した後、ウェハーであるマスターの上にこの混合液を流し込みます。流し込みの際にウェハーが動かないように、テープで固定しています。ウェハーの上にPDMS混合液を流し込む前に、表面に付着している可能性のあるホコリを可能な限り取り除き、ウェハーを清潔な状態にします。

コンプレッサーを起動してウェハーの除塵を行います。さて、PDMSに多くの気泡があることがわかります。そこで、これを真空チャンバーに入れることで気泡を除去します。

真空脱泡には、すべての気泡を除去するのに概ね30分かかります。気泡の除去が完了したら、これを取り出して65 °Cのオーブンに入れ、少なくとも12時間焼き付けます。12時間後には、ウェハーを切断できる状態になります。

このナイフを使用してPDMSを切り、ウェハーからPDMSを取り出します。次に、このホールパンチを使用して、チューブの入口と出口のための穴を開けます。切断する際は、ナイフがウェハーに触れるまで切り込みを入れますが、ウェハーを破損させないよう、過剰な圧力をかけずにチャンネルの周囲を切ってください。準備ができたら、剥がし取ります。

ご覧の通り、これがウェハーのパターンから転写されたチャネルです。したがって、両者が同一であることがわかります。そして現在、このパターンがこのポリマーであるPDMSに刻印されています。

これをガラススライドに接合させると、これが実験用のチャネルになります。次の重要なステップは、PDMSのマイクロチャネルに穴を開け、インレット（入口）とアウトレット（出口）を挿入できるようにすることです。ここでは、溝があるチャネル側にスコッチテープを貼り付けて固定しました。

このチャネルをセロハンテープで貼り付ける理由は、すべての塵粒子を除去するためです。次のステップはプラズマボンディングです。別のラボで行うプラズマボンディングの前に、テープを剥がして接合したい面、つまりこの面とガラススライドを露出させ、それらを酸素プラズマにさらします。その後、それらを合わせると接合されます。

こんにちは。私はジャスティン・セイモアです。MITのローマン・ストッカー研究室で博士研究員として活動しています。私の研究は微生物生態学に焦点を当てており、より具体的には、海洋微生物が海洋中の餌のパッチをどのようにして見つけることができるかについて研究しています。私たちは、こうしたパターンの解析にマイクロフルイディクス技術を用いています。

ここでは、先にマーカスが作製方法を実演した、プラズマボンディング後のチャネルを使用します。これにより、マイクロフルイディクス実験への適用が可能になります。本実験に先立ち、使用する基板の準備を行う必要があります。

本日の実験では、海洋植物プランクトンの Donella turcica がどのようにしてマイクロスケールの餌のパッチを見つけることができるかについて検討します。今回の餌はアンモニウムであり、100 µM 濃度のアンモニウムを供給します。これらの実験では、提供する栄養素に蛍光染料を添加することで、餌のパッチを可視化することができます。

そこでフルオレセイン染料を使用します。ここでは、栄養剤として使用するアンモニウムに、最終濃度 100 µM となるようにフルオレセインをピペッティングしています。これにより、蛍光顕微鏡下でこの栄養剤を可視化することができ、栄養剤のパッチがどのように拡散していくか、そしてその栄養剤パッチに対する生物の反応を観察することが可能になります。

マイクロフルイディクス実験では、ガラス製シリンジを使用します。まず、使用するシリンジに基質と生物を添加します。次に、チューブをマイクロフルイディクス装置に挿入します。

この操作は顕微鏡ステージ上で行います。マイクロ流路チャンネルを顕微鏡ステージに設置し、入口と出口にチューブを挿入します。次に廃棄液リザーバーを設置し、リザーバー内のチューブが完全に浸るように、液を満たして半分まで充填します。

これにより、チャネル内の圧力を一定に保つことができます。次に、生物（本ケースではdonella、lector）と栄養基質（本ケースではammonium）を含むマイクロフルイディクスチャネルに供給するチューブにシリンジを装着します。その後、顕微鏡をセットアップし、実験を開始する前にマイクロフルイディクスチャネルが適切な位置にあるかを確認します。

チャンネルが定位置に配置されたら、カメラに切り替えてチャンネルを確認し、コンピュータ上で可視化します。これで、フォーカスのより微細な調整が可能になり、栄養剤を注入するためのインジェクターを視認できます。このインジェクターは、マイクロ流路チャンネルに組み込まれた 100 µm の有線針先で構成されています。

栄養素を注入することで、濃度勾配を形成させることができます。実験を開始する前のこの段階で、マイクロ流路系内に混入した気泡をすべて除去する必要があります。ここでは、人工海水を満たしたシリンジを使用し、バルブを介してマイクロ流路チャネルに接続して気泡の除去を行います。

次に、このシリンジを押し、チャネル内から気泡を除去します。気泡の除去には2つの方法があります。シリンジによって生じた圧力で気泡をアウトレットから強制的に排出する方法と、ガス透過性を持つPDMS材料の壁面を通して気泡を排出させる方法です。気泡が除去され、実験の準備が整ったら、シリンジポンプを用いて、チャネルへの注入液および材料の適切な流速を設定します。

本ケースでは、流速を2 µL/minに設定しています。これはチャネル内の流速に換算すると266 µm/sに相当します。適切な流速を設定した後、フローを開始して実験を始めると、栄養分の薄いバンドが形成されます。栄養分にフルオレセイン色素を添加し、APF蛍光顕微鏡下で観察することで、注入点からチャネル内に注入される栄養分を可視化できます。その後、マイクロ流路チャネルのフローを停止させ、元の位置から側方に拡散した栄養分のバンドを可視化することで、パッチダイナミクスを観察することが可能です。

次に、位相差顕微鏡に切り替えて、チャネル内を泳ぐ生物を視覚化し、栄養塩パッチに対するそれらの位置を確認します。1秒間に10フレームのフレームレートで一連のフレームを撮影することで、これらの生物を視覚化できる動画を作成します。さらに、あるフレームから直前のフレームを差し引くという2つの個別のフレーム間の時間差を取ることで、移動している物体のみを視覚化し、泳いでいる生物を確認することができます。

これにより、画像から背景ノイズを除去することができます。次に、栄養パッチを最初に放出した後、10分から20分間、一定の間隔で動画を記録します。画像解析ソフトウェアを用いて、シーケンス内のあるフレームから別のフレームへ生物の位置を重ね合わせることで、これらの生物の位置変化を観察し、遊泳軌跡に関する情報を得ることができます。そこから、速度や方向転換を含む、遊泳統計に関するより詳細な情報を得ることが可能です。

これらの実験により、海洋微生物がどのようにしてマイクロスケールの栄養塩パッチを発見し、それを利用できるのかを初めて直接的に検証することができました。これは、海洋における栄養段階のダイナミクスや栄養塩サイクルにとって重要な意味を持つ可能性があります。ジャスティンが述べたことに続き、微生物、特に細菌が海洋中でどのように餌と相互作用するかが、生物地球化学的サイクルに多くの影響を及ぼすと考えられます。

しかしながら、海洋は決して静止しているわけではなく、風や海面によって生成される乱流など、多くの流れの状態が存在します。微生物のスケールにおいて、彼らが実際に経験しているのは大規模な乱流ではなく、せん断力や、乱流の最小の残滓であるコールグラフ・エディ（Kolmogorov eddy）と呼ばれるものです。本研究で私たちが取り組もうとしているのは、このエディが微生物の遊泳行動にどのような影響を与えるかを解明することです。

そして、そのために、先ほどお見せしたこの質量を用いて別のチャネルを作成します。中心には空洞があります。図を大きくするために描き足しましょう。

これがチャネルの外観です。これは上から見た図で、左から右へ流れを注入します。せん断力により、このキャビティ内部に再循環領域が生成されます。このキャビティは、グラフトの Addis を再現したものです。先ほど Justin が説明したセットアップをそのまま使用できます。シリンジポンプをオフにし、流れを全く出していない状態では、細菌がこのキャビティ内でほぼランダムに、活発に泳いでいるのがわかります。

また、優先的な配向は見られません。そして、現在ご覧いただいている動画は時間差（タイムディファレンス）動画であり、これはジャスティンが使用しているものと全く同じ手法です。ご覧の通り、流れが非常に速いとき、細菌は渦によって押し流されています。

そして、細菌自体の軌跡は渦の流線に従います。さらに興味深いのは、シリンジポンプを起動させた後の挙動です。ただし、速度はそれほど速くありません。

細菌が対抗できないほど速すぎるということはありません。しかし、ある意味では、この動画の中で渦のような様子をはっきりと確認できます。したがって、この実験から、非常に強い乱流が存在する場合、細菌は流れに翻弄され、流れに対抗することはできないということが分かりました。

しかしながら、緩やかな乱流領域において、彼らは依然として自力で泳ぐことができます。