網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

本手順の目的は、モデルとして使用可能なヒト胎児網膜色素上皮（RPE）の培養細胞を調製することです。ヒトの眼疾患の研究では、ドナーから完全な眼球として組織が提供されます。本手順の最初のステップでは、余分な筋肉および結合組織を取り除き、角膜と水晶体を除去して眼球を開きます。

眼球をdispaで処理して平坦化し、その後、脈絡膜からRPE単層を剥離します。剥離したRPEをフラスコに播種し、コンフルエントな単層となり色素が形成されるまで数週間培養します。この細胞培養物をin vitroの機能実験に使用します。

成功したin vitro実験は、より複雑なシグナル伝達環境においてRPEの反応をより適切に評価できる、前臨床試験の動物モデルで再現されます。ここで提示するモデルは、RPEの生理学的理解を深め、眼疾患を治療するための新たな治療介入につながるでしょう。こんにちは、シェルドン・ミラーです。

私の研究室は、メリーランド州ベセスダにある国立衛生研究所（NIH）の国立眼科研究所（NEI）内にあります。こんにちは、ミラー研究室のArkiです。今日は、ヒト胎児網膜色素上皮細胞の初代培養を調製する手順をご紹介します。

これらの細胞は、 модиfied sing chamberに搭載可能なコンフルエントな単層として調製します。また、これらの単離したヒトRPE細胞を、生化学および遺伝学の研究にも使用します。当研究室では、生理学的および病理生理学的プロセスの機能と調節を研究し、疾患の臨床動物モデルを開発するために、上皮細胞の一次培養を確立するこの手順を用いています。

ここでは、眼球の背面に位置し、神経網膜と脈絡膜の血流を隔てている網膜色素上皮（RPE）に焦点を当てます。この眼球の模式図は、光受容体に隣接した眼球後方におけるRPE層の位置を示しています。挿入図は網膜の細胞を示しており、右側に光受容細胞、左側に神経節細胞が配置されています。

この上皮は代謝が非常に活発です。日周的に光受容体を絶えず食作用で取り込み、視覚色素のビタミンAを貯蔵、変換し、光受容体へと輸送します。視覚サイクルにおいて、この上皮は周囲の細胞外空間の化学組成と体積を維持するために恒常的に作用します。

上皮細胞の極性は極めて重要な特性です。タンパク質を頂端膜および基底外側膜へと非対称に輸送し続けることは調節されたプロセスであり、これにより上皮は代謝物、イオン、および液体をある細胞外空間から別の細胞外空間へとベクトル輸送することが可能になります。この活性は、上皮が神経網膜の健康と完全性を維持するのに役立っています。

ここで説明するin vitro調製法では、解剖を開始する前に、上皮の極性と機能を決定する輸送タンパク質、受容体、およびシグナル伝達経路の解析が可能になります。ラミナーフローフード内で、室温の溶液を用いて12ウェルプレートを準備します。眼球1つにつき、10×抗生物質・抗真菌剤溶液を入れたウェル1つ、1×PBSを入れたウェル2つ、および血清含有5% RPE培地で2 U/mLに希釈したdisc spaceを入れたウェル1つが必要です。シリコンパッド付きの解剖皿に1×HBSSを満たし、液体を排出した後、各眼球を抗生物質・抗真菌剤溶液のウェルにそれぞれ移します。

室温で3〜5分間インキュベートします。眼球に過剰な圧力をかけないように注意してください。1XPBSを満たした2つのウェルで順次眼を洗浄し、余分な抗生物質を除去します。

次に、解剖用ステレオ顕微鏡下で、ピンセットを使用してそれを1 X-H-B-S-Sを満たした解剖皿に移します。アイリス鋏を用いて、眼周囲の余分な筋肉および結合組織を除去します。角膜が上を向くように眼を配置します。

2本の滅菌済み27ゲージ針を用い、強膜を傷つけないように結合組織で眼球をシリコンパッドに固定します。この状態で、サイドポートナイフを使用して強膜を切開します。切開箇所は、眼球の赤道から前方表面までの距離の3分の1の位置としてください。

アイリスシザーを使用し、眼の周囲を円形に切り進めます。これは、硝子体網膜牽引による網膜色素上皮（RPE）の損傷を避けるためです。同じシザーで硝子体を切り離し、眼の前方フラップをアイカップから分離します。

IOAの前部を持ち上げて取り除きます。ピンセットを使用して、開眼した眼球をdysのウェルに移します。眼球内に気泡が入っていないことを確認してください。

5% 二酸化炭素存在下、37 °Cで40〜60分間インキュベートする。眼球をディッシュから、新鮮な室温の1 X-H-B-S-Sを満たした解剖皿に戻す。眼球をカップが上を向くように配置し、27ゲージの針2本で固定する。

解剖顕微鏡下で、精細鑷子を用いて部分的に剥離した網膜を優しく持ち上げ、網膜用鋏で切断します。視神経から網膜を切り離し、虹彩用鋏で網膜を除去します。

眼球の周辺部から視神経に向かって切開します。5本の27ゲージ針を用いて眼球を固定し、広げます。RPE層を伸展させるため、網膜用ハサミを使用して視神経の周囲を円周状に切開します。

倍率を250倍以上に切り替えて、RPE層を分離します。アイリス scissorsで切開した箇所に沿って、視神経に近いRPEシートの端を探します。2組のピンセットを使用して、RPEおよびBruch膜を脈絡膜組織層から分離します。

切断端に沿って数か所を試し、RPE（網膜色素上皮）と脈絡膜の結合が最も弱い箇所を探します。膜を慎重に剥離し、完全に除去します。RPEシートを、室温のEDTA入りtrypsinを満たした15 milliliterコニカルチューブに入れます。

すべてのシートを回収したら、チューブにキャップをし、37 °Cの水槽で10分間インキュベートします。チューブを激しく振って、RPEを小さなクラスターに分離させます。暗色の細胞塊が見られなくなれば、分離は完了です。

チューブをウォーターバスに戻し、さらに5分間保持します。ペーストラー、ピペット、および緩やかな吸引を用いて、未消化の組織残渣を除去します。遠心分離機を用いて、280 5Gで4分間、細胞をスピンダウンします。

上清を除去します。15% RPE培地を加えて最終容量を9 mLにし、ピペッティングして再懸濁します。細胞懸濁液 3 mLを25 cm²フラスコに分注します。

室温の新鮮な15% RPE培地を2 mL加えます。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩培養します。培養が進むにつれて、3〜4週間後に色素沈着が増加します。

培養に成功すれば、細胞はコンフルエントになり、均一に濃い色素を呈します。以上で、ヒト胎児網膜色素上皮（RP）一次培養の調製方法について説明しました。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。