器官型フルスキン再構築物の生成:ヒト皮膚サンプルを用いた3次元皮膚モデルの構築法

皮膚は主に上部表皮層と下部真皮層で構成されています。表皮細胞は、基部に存在する最も分化していない細胞から末梢の高分化細胞まで、複数の層に層状化されています。正常な皮膚の形態学的および生化学的側面を模倣した皮膚組織を成長させるために、器官型皮膚モデルを確立することができます。

まず、膜状のインサートを備えたマルチウェルプレートを取ります。コラーゲンを混ぜた真皮線維芽細胞をインサートに加えます。インキュベートしてコラーゲンマトリックスの固化を促進し、線維芽細胞を埋め込み、皮膚の真皮コンパートメントを模倣します。

次に、ケラチノサイト細胞懸濁液を真皮層に加えます。プレートをインキュベートして、ケラチノサイトが真皮コンパートメントに接着できるようにします。培養物に表皮化培地を補充して、ケラチノサイトの増殖と表皮層の形成を開始します。

最後に、インサートを新しいマルチウェルプレートに移します。構造物の基部のみを覆うように成層媒体を追加し、それによって気液界面を作成します。インキュベーションすると、気液界面はケラチノサイトの層状多層表皮への分化を促進します。

次のプロトコルでは、分離されたヒト皮膚細胞から真皮および表皮に対応する3D器官型皮膚再構築物を生成します。

皮膚再建物の真皮対応物を生成するには、8マイクロメートルの細孔サイズのメンブレンインサートを24ウェル細胞培養プレートに配置します。各インサートについて、100,000個の線維芽細胞をゲル中和溶液に再懸濁します。次に、線維芽細胞懸濁液をコラーゲン1型とコラーゲン1型を、気泡を形成せずに最終容量500マイクロリットルで1:3の比率で迅速に混合します。

次に、ピペットを使用してサスペンションを各インサートに追加します。滅菌フードの内側に、インサートを培地なしで室温で30分間置き、真皮ゲルが沈殿するまで待ちます。次に、ゲルをDMEMで覆い、摂氏37度で一晩インキュベートします。

一晩のインキュベーション後、真皮ゲルからDMEMを取り出し、摂氏37度で2時間EGMで平衡化して、皮膚再建の表皮対応物を生成します。次に、ピペットを使用してゲルからEGMを取り出します。

次に、100 μリットルの EGM に再懸濁した 100,000 個のケラチノサイトを各ゲルの上に慎重に密封します。再構築物を摂氏37度で1.5時間インキュベートして、ケラチノサイトが真皮ゲルに付着することを確認します。ピペットチップを使用して、インサート壁から残留ゲルを慎重に取り除きます。

次に、各再構築物を800マイクロリットルのEGMで覆い、5%の二酸化炭素で摂氏37度で7日間培養します。

小さな白いピペットチップでインサート壁から残留ゲルを慎重に取り除きます。

8日目に、インサートを6ウェルプレートの別々のウェルに入れます。次に、1.2〜1.4ミリリットルの転移性黒色腫培地を各ウェルに追加して、皮膚再建の基部のみを覆います。その後、5%二酸化炭素中で摂氏37度で10〜17日間インキュベートします。

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

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• What does the process of epidermalization entail?
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• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.