JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 6:00 分 • April 30th, 2023
- HCR-FISH(ハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光in situハイブリダイゼーション)は、ウイルス感染細胞のゲノム内のウイルス核酸配列を検出します。まず、ウイルスに感染した細胞の接着培養物を固定し、その細胞膜を透過させます。ハイブリダイゼーションバッファーで細胞をインキュベートし、バックグラウンドシグナルを低減します。HCRイニシエーター配列とウイルスDNAを標的とする相補的配列を持つイニシエータープローブで細胞を処理します。サンプルを加熱して、宿主の二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性させます。サンプルをインキュベートして、プローブが相補的な標的ウイルスDNA配列に結合できるようにします。
次に、蛍光標識オリゴヌクレオチドヘアピンプローブH1およびH2の2セットを含む増幅バッファーで処理します。ハイブリダイゼーション連鎖反応を促進するためにインキュベートします。不対開始者配列は、その相補的なH1テールに結合し、ヘアピン構造を線形化します。露出したH1配列は、その相補的なH2テールにも同様に結合します。後続のH2は、H1テールに結合し続けます。このようにして、蛍光タグ付きプローブは標的部位の周囲で増幅し、強いシグナルを発します。サンプルをDAPIで処理して、細胞核を染色します。
蛍光顕微鏡を使用して、感染細胞の核内の複製病巣からの明るい蛍光を検出します。次のプロトコルでは、感染した初代ヒト皮膚細胞のメルケル細胞ポリオーマウイルスゲノムを検出するために、in situ HCR-DNA FISHを示します。
- まず、細胞をPBS中の4%PFAでカバースリップに10分間固定します。次に、カバースリップをPBSで2回洗浄し、摂氏4度の70%エタノールで一晩処理して細胞を透過させます。翌日、エタノールをプローブ水和緩衝液に交換し、室温で60分間インキュベートしてサンプルをプレハイブリダイズします。プレハイブリダイゼーションインキュベーションが終了する30分前に、プローブをプローブハイブリダイゼーション溶液で1:500の希釈で希釈し、摂氏45度でインキュベートします。
インキュベーションが完了したら、希釈したプローブ混合物の約10マイクロリットルを顕微鏡スライド上にピペットで移し、各カバースリップについて観察します。各カバースリップを細胞側を下にして、それぞれのハイブリダイゼーションミックス液滴の上に置きます。たっぷりのゴムセメントを使用して、各カバースリップの端と背面をスライドに密封します。スライドをヒートブロックの平らな面にセットし、摂氏94度に3分間加熱します。この後、スライドを加湿チャンバーに移し、摂氏45度で一晩インキュベートします。
翌日、鉗子を使用してゴムセメントを慎重に剥がします。カバースリップを細胞側を上にして24ウェルプレートのウェルに入れ、プローブ洗浄バッファーで室温で3回洗浄します。カバースリップを含む各ウェルに200マイクロリットルの増幅バッファーを加え、室温で30〜60分間インキュベートします。一方、プローブを認識する2つの標識オリゴヌクレオチドヘアピンをそれぞれ別々のPCRチューブでアニールします。プローブを摂氏95度まで90秒間加熱した後、室温まで30分間冷却します。ヘアピンを増幅バッファーで1:50の希釈で混合します。
次に、12ウェルプレートの蓋の開放面にパラフィンフィルムを伸ばして、増幅反応の表面を作ります。ヘアピン混合物の50〜100マイクロリットルの液滴を各カバースリップのパラフィンフィルムにピペットで貼り付けます。鉗子を使用して、各カバースリップを増幅前溶液から慎重に取り除き、端を多孔質の使い捨てワイプに触れて乾かします。乾燥させた各カバースリップを細胞側を下にして、増幅液滴の上に置きます。プレートの蓋を加湿チャンバーに移し、室温で暗所で一晩インキュベートします。
翌日、カバースリップを24ウェルプレートのウェルに戻します。各ウェルに0.5μg/mLの濃度で5x SSCT含有DAPIを添加し、室温で1時間インキュベートします。この後、サンプルを室温で5x SSCTで2回洗浄します。洗浄したカバースリップを顕微鏡スライドに取り付け、倒立蛍光顕微鏡を使用して細胞を分析し、サンプルをイメージングします。