HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

- HCR-FISH(ハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光in situハイブリダイゼーション)は、ウイルス感染細胞のゲノム内のウイルス核酸配列を検出します。まず、ウイルスに感染した細胞の接着培養物を固定し、その細胞膜を透過させます。ハイブリダイゼーションバッファーで細胞をインキュベートし、バックグラウンドシグナルを低減します。HCRイニシエーター配列とウイルスDNAを標的とする相補的配列を持つイニシエータープローブで細胞を処理します。サンプルを加熱して、宿主の二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性させます。サンプルをインキュベートして、プローブが相補的な標的ウイルスDNA配列に結合できるようにします。

次に、蛍光標識オリゴヌクレオチドヘアピンプローブH1およびH2の2セットを含む増幅バッファーで処理します。ハイブリダイゼーション連鎖反応を促進するためにインキュベートします。不対開始者配列は、その相補的なH1テールに結合し、ヘアピン構造を線形化します。露出したH1配列は、その相補的なH2テールにも同様に結合します。後続のH2は、H1テールに結合し続けます。このようにして、蛍光タグ付きプローブは標的部位の周囲で増幅し、強いシグナルを発します。サンプルをDAPIで処理して、細胞核を染色します。

蛍光顕微鏡を使用して、感染細胞の核内の複製病巣からの明るい蛍光を検出します。次のプロトコルでは、感染した初代ヒト皮膚細胞のメルケル細胞ポリオーマウイルスゲノムを検出するために、in situ HCR-DNA FISHを示します。

- まず、細胞をPBS中の4%PFAでカバースリップに10分間固定します。次に、カバースリップをPBSで2回洗浄し、摂氏4度の70%エタノールで一晩処理して細胞を透過させます。翌日、エタノールをプローブ水和緩衝液に交換し、室温で60分間インキュベートしてサンプルをプレハイブリダイズします。プレハイブリダイゼーションインキュベーションが終了する30分前に、プローブをプローブハイブリダイゼーション溶液で1:500の希釈で希釈し、摂氏45度でインキュベートします。

インキュベーションが完了したら、希釈したプローブ混合物の約10マイクロリットルを顕微鏡スライド上にピペットで移し、各カバースリップについて観察します。各カバースリップを細胞側を下にして、それぞれのハイブリダイゼーションミックス液滴の上に置きます。たっぷりのゴムセメントを使用して、各カバースリップの端と背面をスライドに密封します。スライドをヒートブロックの平らな面にセットし、摂氏94度に3分間加熱します。この後、スライドを加湿チャンバーに移し、摂氏45度で一晩インキュベートします。

翌日、鉗子を使用してゴムセメントを慎重に剥がします。カバースリップを細胞側を上にして24ウェルプレートのウェルに入れ、プ