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- ケラチノサイトは、表皮、または皮膚の最外層に存在する最も顕著な細胞です。それらは真皮上に複数の層に配置され、メラノサイト、樹状細胞、メルケル細胞などの他のさまざまな細胞タイプと関連しています。
ケラチノサイトを単離するには、まずヒトの皮膚から表皮組織を採取します。次に、酵素消化バッファーで処理します。バッファー中の酵素は、表皮組織に存在する細胞外マトリックスタンパク質を分解し、それによって細胞の解離を開始します。次に、適切な培地を追加し、組織を機械的に破壊します。
解離した細胞を懸濁液に放出するには、表皮細胞懸濁液をストレーナーでろ過し、細胞の凝集物や破片を取り除きます。遠心分離機で表皮細胞をペレット化し、酵素含有上清から分離します。上清を除去し、好ましいケラチノサイト増殖培地を使用して細胞を再懸濁します。細胞を所望の期間培養します。
培養中、最適化された培地は、他の表皮細胞タイプよりも選択的な増殖を促進することにより、ケラチノサイトの増殖を濃縮します。次のプロトコルでは、成人ヒトの皮膚組織からのケラチノサイトの単離を示します。
- 形成外科手術を受けている健康な成人ボランティアから10センチ×15センチメートルの皮膚サンプルを収集します。冷却要素が入った発泡スチロールの箱で皮膚サンプルを輸送することにより、皮膚を涼しく保ちます。必要に応じて、皮膚サンプルを摂氏4度で一晩保管します。滅菌したハサミやメス、鉗子などを使って、皮膚部分の下から脂肪を取り除きます。
次に、針を使用して、プレートの上にある滅菌カバーの皮膚部分をバックルで締めます。乾燥した滅菌済みのガーゼパッドで、肌をきれいにします。次に、滅菌したガーゼパッドに70%エタノールを塗ります。次に、フットプレーナーを使用して、皮膚部分の上部表皮層を切り取り、9センチのシャーレに移します。
次に、すぐに25ミリリットルの以前に調製したDPBS /トリプシン/グルコース溶液をペトリ皿に加えます。サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。ピペットを使用して、ペトリ皿からDPBS /トリプシン/グルコース溶液を取り出し、10ミリリットルのRPMI-1640と2%FBSを追加してトリプシンを不活性化します。
次に、2つの鉗子を使用して、皮膚切片の表皮と真皮コンパートメントの両方を穏やかにこすり、攪拌することにより、表皮細胞を培地に放出します。表皮細胞懸濁液を金属フィルターでろ過し、濾液を50ミリリットルのチューブに集めます。残りの皮膚部分を、FBSと渦なしで10ミリリットルのRPMI-1640を含む50ミリリットルのチューブに追加します。
この懸濁液を金属フィルターでろ過し、表皮細胞懸濁液を含む50ミリリットルのチューブに入れます。次に、DPBSを総容量50ミリリットルに追加します。細胞懸濁液を450 x gで室温で10分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、細胞ペレットの大きさにもよりますが、表皮細胞ペレットを摂氏37度のKSFMの約10ミリリットルに再懸濁します。
トリパンブルー染色法を使用して、顕微鏡で細胞をカウントします。次いで、各75平方センチメートルの培養フラスコに、摂氏37度のKSFMの12ミリリットルと共に6番目の細胞に10の8倍を移す。培養フラスコを静かに振って、細胞が均一に分布するようにします。ケラチノサイトを摂氏37度のインキュベーターで湿度100%、CO25%でインキュベートします。2日後に培地を交換し、その後は週に3回交換します。
