黒色腫幹細胞の単離:磁気活性化細胞選別を使用してCD133陽性および陰性黒色腫細胞を取得する方法

- メラノーマには、自己複製能力と腫瘍開始能力の両方を持つがん幹細胞の小さな亜集団が存在します。CD133またはプロミニン-1は、ペンタパン膜貫通糖タンパク質であり、転移性黒色腫がん幹細胞によって発現される重要なマーカーの1つです。CD133陽性細胞を単離するには、まず、初代黒色腫細胞を適切な緩衝液に懸濁します。

細胞表面の非特異的結合部位をブロックするタンパク質を含むブロッキング試薬とインキュベートします。細胞をビオチン化CD133一次抗体で処理します。これらの抗体は、CD133陽性細胞上に発現するCD133抗原に結合します。次に、懸濁液に抗ビオチン磁性マイクロビーズを追加します。マイクロビーズがビオチン標識細胞に結合するまでインキュベートします。

最後に、インキュベートした懸濁液を磁場中に置かれたカラムに通します。磁気の影響により、マイクロビーズで標識されたすべてのCD133陽性細胞がカラムに付着し、標識されていない細胞は通過します。これらの非標識CD133陰性細胞を回収します。カラムを磁場から取り外します。適切なバッファーを使用して内容物をフラッシュし、CD133陽性細胞を溶出して回収します。

次のプロトコルでは、腫瘍組織から得られた原発性黒色腫の培養物からのCD133陽性および陰性の癌幹細胞の単離を示します。80%コンフルエントセルを予熱したPBSで洗浄します。適量のアキュターゼを添加し、細胞が培養表面から剥離するまでインキュベートします。Quantum 263培地で細胞を採取し、50ミリリットルのチューブに移します。

セルを列挙します。次に、必要な数の細胞を300 x g、摂氏4〜8度で5分間遠心分離します。上清を完全に吸引し、350マイクロリットルのMACSバッファーに1×10を8番目の細胞まで1倍まで再懸濁します。100マイクロリットルのFcRブロッキング試薬と50マイクロリットルのCD133/1-ビオチンを追加します。よく混ぜ合わせ、摂氏4度で10分間インキュベートします。

細胞を10ミリリットルのMACSバッファーで洗浄し、続いて300 x gおよび摂氏4〜8度で5分間遠心分離します。上清を完全に吸引します。2回目の洗浄後、細胞ペレットを400マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁します。100マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズを加えてよく混ぜます。4〜8°Cで15分間インキュベートします。

一方、磁気分離用のMACSセパレータを準備するには、QuadroMACSをMACSセパレータマルチスタンドに取り付けます。カラムウィングを前面に向け、必要な数のLSカラムをQuadroMACSの磁場に挿入します。Pre-Separation Filterを各LSカラムに、各カラムの下に適切な収集チューブをセットします。

フィルターとカラムを3ミリリットルのMACSバッファーですすぎ、流れを捨てます。前述のようにMACSバッファーで細胞を洗浄した後、細胞を500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁し、調製したLSカラムに細胞懸濁液を塗布します。カラムあたり3ミリリットルのMACSバッファーで3回洗浄します。非標識CD133陰性細胞画分の全廃液を回収します。

次に、プレセパレーションフィルターを廃棄し、カラムをセパレーターから取り外して、適切な収集チューブに置きます。5ミリリットルのMACSバッファーを適用します。標識されたCD133陽性細胞を、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、直ちに洗い流します。ネガティブフラクションの純度を上げるには、細胞懸濁液を新しい平衡化LSカラムにアプライし、廃液CD133ネガティブフラクションを回収します。

• Melanoma - A type of skin cancer with self-renewing tumor initiation capabilities.
• CD133 - A marker in metastatic melanoma stem cells that enables their isolation.
• MACS Separator - A device used for magnetic cell sorting isolation.
• Quantum 263 medium - A culture medium used for melanoma cell cultivation.
• Anti-Biotin Microbeads - Tiny magnetic particles used to label cells for isolation.

• Understanding Melanoma - It's a skin cancer with self-renewable tumor cells (e.g., MACS separator).
• Principles of Magnetic Cell Sorting - The process of sorting cells based on their magnetic properties (e.g., CD133).
• Role of Microbeads - They assist in segregating cells during magnetic isolation (e.g., Anti-Biotin Microbeads).
• Isolation of CD133 - The melanoma stem cells are differentiated using MACS separator.

• [Question 1] What is melanoma and how is it connected to CD133 stem cells?
• [Question 2] What role does a MACS separator play in cell isolation?
• [Question 3] How are Anti-Biotin Microbeads used in the magnetic cell isolation process?

• Cell Isolation Techniques - Understanding melanoma therapy (e.g., MACS Separator).
• Medical Industry Impact - Improved cancer treatment methodologies (e.g., CD133).
• Scientific Progression - Better understanding of stem cells can lead to medical advancements.
• Research Developments - Isolation techniques pave way for newer studies.