0 閲覧数 • 5:54 分 • April 30th, 2023
- 皮膚は、そのさまざまな層に存在するさまざまな細胞で構成されています。メラニン産生細胞であるメラノサイトは表皮-真皮接合部に局在し、結合組織生成細胞である線維芽細胞は真皮に存在します。
メラノサイトと線維芽細胞を迅速に分離するには、安楽死させたマウスの子犬の体幹を採取することから始めます。体幹の長さに沿って皮膚を腹側に切ります。表皮層と真皮層を含む皮膚をはがし、組織を細かく刻みます。
次に、トリプシンとコラゲナーゼ酵素を含む消化バッファーで処理し、細胞を細胞外マトリックスを分解し、細胞を懸濁液に放出します。遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄します。細胞をメラノサイト培地に再懸濁し、懸濁液をマルチウェルプレートに移します。
培養中、ほとんどの線維芽細胞はウェルボトムに付着しますが、メラノサイトやその他の表皮細胞は懸濁液のままです。懸濁した細胞を吸引し、線維芽細胞培養物に線維芽細胞特異的培地を添加して、その増殖を促進します。吸引した懸濁液を新鮮なコラーゲンでコーティングされたウェルに移し、付着性培養の形成を助けます。
抗生物質であるジェネチシンを補給し、新鮮なメラノサイト増殖培地を追加します。ジェネチシンは、残っている線維芽細胞を選択的に排除し、培地は他の表皮細胞タイプよりもメラノサイトの増殖を促進します。次のプロトコルでは、マウスの子犬の皮膚からメラノサイトと線維芽細胞を分離します。
- 層流キャビネットで、安楽死させた各マウスの体幹を70%エタノールを含む滅菌ペトリ皿で短時間転がします。マウスをエタノールから取り出し、空の滅菌ペトリ皿に入れます。次に、手術用ハサミを70%エタノールで滅菌します。これらのはさみを使用して、首から尾まで続く、体幹の腹側の皮膚に切開を行います。滅菌鉗子を使用して、マウスの体幹から皮膚を剥がし、皮膚の真皮側から余分な脂肪組織を取り除きます。
真皮を下にして、3ミリリットルの1x抗生物質/抗真菌溶液を含む6ウェル皿に皮膚を置きます。室温で2〜3分間インキュベートします。次に、ティッシュチョッパーの電源を入れ、設定をここに示されているものに調整します。
- ティッシュチョッパーブレードの取り付け時や機械の操作には十分注意してください。
- 真皮を下にして皮膚を滅菌ティッシュチョッパー皿に移し、ティッシュチョッパーに皮膚を完全に3回通します。この後、均質化された皮膚を、3ミリリットルの皮膚消化緩衝液を含む滅菌15ミリリットルの円錐管に移します。
P1000マイクロピペットを使用して、得られた懸濁液を10〜15回激しく上下させて混合します。コニカルチューブにキャップをし、サンプルを摂氏37度のウォーターバスで15分間インキュベートし、3〜5分ごとにチューブを反転させます。
次に、スイングバケットローターでチューブを750 x g、室温で5分間遠心分離し、皮膚ホモジネート中の細胞をペレット化します。P1000マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さないように注意しながら、ゆっくりと完全に皮膚消化緩衝液を取り除きます。
- 必ずすべての皮膚消化液を吸引してください。問題が発生した場合は、細胞ペレットを2〜3ミリリットルのメラノサイト培地で洗浄し、遠心分離を繰り返して余分な皮膚消化バッファーを取り除きます。
- 次に、P1000ピペットで15〜20回ピペッティングして、細胞ペレットを1ミリリットルのメラノサイト培地に再懸濁します。得られた細胞溶液を、1ミリリットルのメラノサイト培地を含む6ウェル皿のコーティングされていないウェルに滴下します。めっきした皮膚ホモジネートを組織培養インキュベーターで、摂氏37度の組織培養インキュベーターで5%の二酸化炭素と40分間インキュベートします。
この後、培養上清をコーティングされていない皿から、事前に洗浄したコラーゲンコーティングされた6ウェル皿の1ウェルに移します。最終濃度が100ナノグラム/ミリリットルになるように、G418を培地に加えます。2ミリリットルの線維芽細胞培地を、付着性線維芽細胞を含む未コーティング皿の1ウェルに加えます。両方の培養物を、摂氏37度の組織培養インキュベーターで5%の二酸化炭素と一晩インキュベートします。
16〜24時間のインキュベーション後、培地と各培養物からの破片を別々に吸引します。各皿を2回洗い、1回の洗濯に1ミリリットルのPBSを使用します。次に、2ミリリットルの新鮮なメラノサイト培地をメラノサイト培養物に加え、2ミリリットルの新鮮な線維芽細胞培地を線維芽細胞培養物に加えます。