ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

本手順の全体的な目的は、ランダムライブラリから、特定の標的タンパク質（本ケースでは S 100 B タンパク質）に特異的に結合するアプタマーを同定することです。これは、まず制限内切断酵素でライブラリを消化し、隣接する固定プライマー配列からランダム配列を遊離させることで達成されます。手順の第2ステップは、ランダムライブラリ配列を精製 S 100 B タンパク質に結合させ、それらを回収することです。

手順の第3ステップは、ハイブリダイゼーションとライゲーションによって、結合した配列を固定プライマー配列と再結合させることです。手順の最終ステップは、ライゲーション産物を転写し、結合した候補aberプールのRT-PCRによる再増幅を可能にし、その後さらにこの選択手順を繰り返すことです。最終的に、選択されたaberがS 100 Bタンパク質に特異的に結合することを示す結果を得ることができます。

例えば、ここではマイクロアレイを用いたサンドイッチ結合アッセイが行われており、また、機能化されたナノワイヤと15 nanometerの金ナノ粒子を結合させた二次抗体を用いた蛍光標識二次抗体アッセイも行われています。本日は、D配列のランダムライブラリからS hundred B proteinに結合する最適な抗体を選別する手順を示します。当研究室では、がんの早期検出のためのセンサープラットフォームの開発など、さまざまな目的でこの手順を利用しています。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、既述の方法に従ってプライマーフリー（PF）DNAライブラリを調製します。二本鎖DNAライブラリを切断し、次いで10%変性ポリアクリルアミドゲルでゲル精製を行うことで、5'末端にリン酸を持つ32ヌクレオチド断片と、5'末端にリン酸を持つ30ヌクレオチド断片が得られます。これらをそれぞれ32+断片および30+断片と定義します。

32プラスフラグメントは、3'末端にCC最小隣接配列を持つ30ヌクレオチドのランダムドメインを含んでいますが、30プラスフラグメントは30ヌクレオチドのランダムドメイン配列のみで構成されています。aptr選択用のPFライブラリーDNAフラグメントを調製するために、32プラスおよび30プラスの各フラグメントを40 µLの20 mM Tris-HCl (pH 7.4) に再懸濁します。その後、サンプルを85 °Cで3分間加熱し、インキュベートします。

サンプルを37 °Cのウォーターバスインキュベーターで3分間冷却します。次に、760 µLのセレクションバッファーを加え、37 °Cで3分間インキュベートします。3分後、サンプルを室温で10分間保持します。インキュベーション後、溶液をセレクションバッファーであらかじめ洗浄したnickel NTA agro beadsを含むカラムに通します。

非特異的なDNAを除去するため、カラムに結合しなかったPFライブラリDNA断片を回収し、後で使用するために保管しておきます。S 100 B結合ビーズを準備するには、まず400 µLのニッケルNDAビーズをマイクロ遠心分離機で3秒間遠心分離し、上清を捨てます。次に、バインディングバッファー400 µLを用いて、ピペッティングを5回静かに行い、ビーズを洗浄します。

次に、ビーズを遠心分離して上清を捨てます。これを繰り返し、2回洗浄します。

次に、以前に精製したヒスチジンタグ付きタンパク質をビーズ上に注ぎます。ここでは、ヒトS100カルシウム結合タンパク質Bを使用します。溶液を3分ごとに5回ずつ、合計15分間、穏やかにピペッティングしてください。

15分後、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。最後に、選択バッファー 400 µLを用いて、ピペッティングを3回ゆっくりと繰り返し、ビーズに結合した S 100 B を洗浄します。再びビーズを遠心分離し、上清を捨てます。

S 100 B結合abersを選択するため、この工程を2回繰り返し、計3回の最終洗浄を行います。あらかじめ取り分けておいた32 plusおよび30 plusフラグメントを回収します。これらのフラグメントをビーズ結合S 100 Bに加えます。その後、サンプルを15分間インキュベートします。

15分後、3分ごとに緩やかにピペッティングして混合し、ビーズを短時間遠心分離して上清を捨てます。次に、800 µLのセレクションバッファーを用い、緩やかにピペッティングしてS 100 BDNA複合体を洗浄します。その後、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。この洗浄工程を2回繰り返します。

S 100を回収するため、20 mM tris, HCL pH 7.4を200 µL、ビーズに添加します。その後、スラリーを85 °Cで3分間加熱します。インキュベーション後、

ビーズを1分間ボルテックスし、遠心分離で沈殿させます。次に、上清を新しいチューブに移します。この操作をもう一度繰り返し、上清を合わせます。

最後に、選択したDNA断片を精製します。PCR産物を、同量のフェノール・クロロホルムおよびイソプロパノールで2回抽出します。250 mMの塩化ナトリウムと2.5倍量の100% Ethanolを加え、-70 °Cで15分間沈殿させます。

4 °C、21,000 GSで15分間遠心分離します。その後、上清を除去します。ペレットを75% ethanolで十分に洗浄してください。

4 °Cで21,000 Gにて5分間遠心分離し、上清を捨てます。10ラウンドの選抜後、ペレットをスピードバキュームで3分間乾燥させます。得られたPCR増幅DNA断片を、Vitrogen Coreから入手したpCR 2.1 TOPOベクターにクローニングします。

次に、選択したN 30 ccおよびN 30フラグメントそれぞれについて、40〜50個のシングルコロニーをM 13フォワードプライマーを用いてシーケンシングします。infomax vector NTIソフトウェアを使用して、選択した配列をアラインメントします。その後、アラインメントに基づきコンセンサス配列を決定します。

コンセンサス配列が特定されたら、書面によるプロトコルに従ってコンセンサスオリゴヌクレオチドを購入します。5'末端にアミノC6基を導入して合成した1番目のアプタマーを、プリンティングバッファーを用いて最終濃度15 µMになるように懸濁します。次に、Apogen Discoveries社のマイクログリッドアレイを用いて、アプタマー溶液をCodeLink活性化スライド上にスポットします。

コードリンクの推奨プロトコルに従ってください。各スライドに12個のアレイを印刷します。2×8のフォーマットを使用してください。

ハイブリダイゼーション用マイクロアレイハイブリダイゼーションカセット。S 100 Bタンパク質を70 µLのPBSで適切な濃度に希釈します。その後、その溶液をマイクロアレイカセットのウェルに添加します。

蒸発を防ぐため、ヌクレアーゼフリーの接着用シーリングフォイルを使用してマイクロアレイカセットを密封します。タンパク質がコードリンク上にプリントされた抗体に結合するようにし、室温で1時間インキュベートします。

カセットのウェルを、5 mM 塩化マグネシウム含有PBSまたはPBSMで3回洗浄します。次に、蛍光標識した二次抗体をPBSM 70 µLで0.125 µMに希釈します。この混合物を85 °Cで3分間加熱します。

その後、ラベル化したABERSを氷上で冷却します。3分間、ABERSをマイクロアレイカセットのウェルに適用します。再度、カセットを粘着性のフォイルで密封し、室温で1時間インキュベートします。

再度、個別に洗浄します。洗浄後、ウェルをPBSMで3回洗ってください。カセットを分解し、スライド全体をPBSMでリンスします。

次に、遠心分離によってスライドを十分に乾燥させます。最後に、Packard Biosciences社製のスキャンアレイを用いてスライドをスキャンします。$\gamma$ P$^{32}$ ATPで5'末端標識したアプタマーとS100Bタンパク質との4,000 XL結合量を測定し、K$_{D}$決定のために濃度に対してプロットしました。

約7ラウンドの選抜後の代表的なKd値は、通常10⁻⁷ Mの範囲になります。5'末端に目的配列を持つ第1アプタマーをCodeLinkマイクロアレイに結合させました。精製したS100Bタンパク質を第1アプタマーに結合させ、続いてLORS 546でラベル化した第2アプタマーを、S100Bを含む第1アプタマー複合体に結合させました。

蛍光強度はスキャンアレイスキャナーを用いて定量しました。中段の行はサンドイッチ結合を示しており、上下の行のKDアッセイにおける相加的な結合によって特徴付けられます。5'末端にチオール修飾した一次抗体に関してはサンドイッチ結合は見られず、標準的なチオール化学を用いて金ナノワイヤに結合させました。

2番目の抗体（abers）を、同様の方法で50 nMのNMOまたは金ナノ粒子（nps）に結合させました。次に、精製したS 100 Bタンパク質をまず誘導体化ナノワイヤ上の第1のアプタマーに結合させ、続いて50 nMの金ナノ粒子結合第2のアプタマーを、第1のアプタマー・ナノワイヤ上のS 100 B複合体に結合させました。結合したサンドイッチ複合体は、FFE-SEMを用いて視覚化しました。

S 100 Bタンパク質の代わりにHTRA 1タンパク質を用いて実施した結合アッセイのネガティブコントロールを確認できます。さて、この手順において最も重要な点の一つは、プライマーフリーのアプローチを採用していることです。これにより、固定配列が存在しないため、配列自体がランダム領域を圧倒することによる偽陽性や偽陰性の発生を防ぐことができます。この手順を実施する際は、各逆転写反応の前にDNAテンプレートを確実に分解し、再増幅後に特定のRT-PCR産物を慎重に単離することが重要です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。