Name: ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学ぶプライマーフリーSELEX法によるS100Bタンパク質特異的アプタマー選択技術。固定プライマー配列を除去し、ランダムDNAライブラリーから高特異性バインダーを効率的に同定する方法です。がん早期診断センサー開発への応用が期待されます。

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我々は彼の助けのためのマイクロアレイの中核施設で、クレイグポールに感謝する。この作業は、IMATプログラムからNIH / NCIの助成金＃CA118591によってサポートされていました。 SLDは、金融支援のためのペンシルベニアスペースグラントコンソーシアムのフェローシップを認めている。この出版物はまた、ペンシルベニア州立大学の材料研究所ナノファブリケーションネットワークと国立科学財団協力協定第0335765、コーネル大学と国家ナノテクノロジー基盤ネットワーク、によってサポートされていました。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotMaster TAQ DNAポリメラーゼ</td><td>5 PRIME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPミックス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBEバッファー</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX174 DNA/Hinf I DNAマーカー</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-dCTP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>制限酵素</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>写真フィルム</td><td>ECE Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTAアガロースビーズ</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンカラム</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detroit-551細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SK-MEL-31細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sp6 RNAポリメラーゼ</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーDNase I</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseインヒビター</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiScript逆転写酵素</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCR-2.1-TOPOベクター</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha;コンピテントセル</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vector NTI</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ランダムdnaライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

アプタマーは、抗体1〜匹敵する親和性を持つターゲットにバインドすることができる高度に構造化されたオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNA）です。彼らは、小分子から蛋白質と他の高分子2-4に、ターゲットの多種多様を認識するために指数濃縮（SELEX） ​​によってリガンドの系統進化と呼ばれる試験管内選択プロセスにおけるを通して識別されます。アプタマーは、よくインビボ診断および/または治療用途のために適しているプロパティがあります：優れた特異性と親和性に加えて、それらが容易に合成され、より厳密な処理条件を生き残る、それらは不完全に免疫原性であり、そしてそれらの比較的小さいサイズではの容易な侵入が発生する可能性が組織。 彼らは通常、それぞれの側に〜40 ntの長い無作為地域プラス〜20ヌクレオチドの固定プライマー部位を有する核酸のライブラリーから選択されるので、標準のSELEXプロセスを通じて識別されるアプタマーは、通常、約80ヌクレオチド（nt）を含む。バイオインフォマティクスのアプローチは、固定の配列が選択5の後にアプタマーの構造に大きく貢献していないことを示唆しているが、固定されたプライマー配列は、このように〜ほぼライブラリー配列の50％を含むことができるため、肯定的または否定的選択プロセス3のアプタマーの同定を危険にさらす可能性があります。 。これらの潜在的な問題に対処するために、プライマーの配列は、相補的なオリゴヌクレオチドによってブロックまたはSELEX 6のラウンド中に、異なるシーケンスの途中に切り替え、またはそれらは6月9日NT 7、8にトリミングされているされています。温とグレー9は 、プライマー、フリーのゲノムSELEX法を設計したプライマーの配列は完全に選択する前に、ライブラリから削除され、その後、選択されたゲノム断片の増幅を可能にするために再生した。しかし、テクニックを採用する、ユニークなゲノムライブラリーは、限られた多様性を有している、構築する必要があり、選択のラウンド後の再生は、リニア再増幅のステップに依存しています。また、高効率のパーティショニングを使用して固定されたプライマー配列によって引き起こされる問題を回避する努力は、PCR増幅10に関する問題で満たされている。 我々は大幅にSELEX手続きを簡素化し、効果的プライマー干渉問題11,12を排除プライマーフリー（PF）の選択方法を開発した。プロトコルは、簡単な方法で動作します。ライブラリの中心的なランダムな領域は、余分なフランキング配列なしで精製され、適切なターゲット（精製されたタンパク質またはそのような細胞株などの複雑な混合物に、例えば）にバインドされています。その後、バインドされたシーケンスは、得られた隣接配列と再会し、選択したサブライブラリーを生成するために再増幅されています。例として、ここでは、S100B、黒色腫のためのタンパク質マーカーにアプタマーを選択する。選択の数ラウンド後に10 -8 Mの範囲を、そして我々はアプタマーは、サンドイッチバインディング形式で効果的に機能することを示している-結合アッセイは、10 -7でのKdのを示した。

SELEXのプロトコールは、順番にランダムライブラリ領域に隣接する固定プライマー配列を必要とする結合リガンドの再生を必要とするそれぞれの選択の複数のラウンドを、含み。これらの固定プライマー配列は、選択プロセス（偽陽性と陰性）の妨げになることがあります。ここでは、プライマーのないプロトコルを提示する。

ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

アプタマーは、抗体に匹敵する親和性で標的に結合できる、高度に構造化されたオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNA）である 1。これらは、...

本手順の総合的な目的は、ランダムライブラリから、標的タンパク質（本ケースではS 100 Bタンパク質）に特異的に結合するaberを同定することです。これはまず、制限エンドヌクレアーゼでライブラリを消化し、隣接する固定プライマー配列からランダム配列を遊離させることで達成されます。手順の第2ステップでは、ランダムライブラリ配列を精製したS 100 Bタンパク質に結合させ、それらを回収します。手順の第3ステップは、ハイブリダイゼーションとライゲーションによって、結合した配列を固定プライマー配列と再結合させることです。手順の最終ステップでは、ライゲーション産物を転写し、結合した候補aberプールのR-T-P-C-Rによる再増幅を可能にし、その後、この選択手順をさらに数ラウンド繰り返します。最終的に、選択されたaberがS 100 Bタンパク質に特異的に結合することを示す結果を得ることができます。例えばここでは、マイクロアレイを用いたサンドイッチ結合アッセイが行われており、また、機能化ナノワイヤと15 nanometerの金ナノ粒子に結合させた蛍光標識二次抗体を用いたアッセイも行われています。本日は、D配列のランダムライブラリからS hundred Bタンパク質に結合する最適なものを選択する手順について解説します。私たちは、癌の早期検出のためのセンサープラットフォームの開発を含め、さまざまな目的でこの手順を研究室で活用しています。それでは開始しましょう。この手順を始めるには、既報の方法に従ってプライマーフリー（PF）DNAライブラリを調製します。二本鎖DNAライブラリを切断し、10%変性ポリアクリルアミドゲルを用いてゲル精製を行うことで、5'末端にリン酸を持つ32ヌクレオチド断片（32+断片）および30ヌクレオチド断片（30+断片）が得られます。32プラスフラグメントは、3'末端にCC最小隣接配列を持つ30ヌクレオチドのランダムドメインを含んでおり、一方、30プラスフラグメントは30ヌクレオチドのランダムドメイン配列のみで構成されています。aptr選択用のPFライブラリーDNAフラグメントを調製するには、32プラスおよび30プラスの各フラグメントを40 µLの20 mM Tris-HCl (pH 7.4) に再懸濁します。その後、サンプルを85 °Cで3分間加熱し、インキュベーションを行います。サンプルを37°Cのウォーターバスインキュベーターで3分間冷却します。次に、760 µLのセレクションバッファーを加え、37°Cで3分間インキュベートします。3分後、サンプルを室温で10分間保持します。インキュベーション後、溶液を、セレクションバッファーであらかじめ洗浄したニッケルNTAアガロースビーズを含むカラムに通します。非特異的なDNAを除去するため、カラムに結合しなかったPFライブラリDNA断片を回収し、後で使用するために保管しておきます。S 100 B結合ビーズを調製するには、まず400 µLのニッケルNDAビーズをマイクロ遠心機で3秒間遠心分離し、上清を捨てます。次に、結合バッファー400 µLを用いて、ピペッティングで5回緩やかに洗浄します。次に、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。この操作を繰り返し、2回洗浄してください。次に、あらかじめ精製したヒスチジンタグ付きタンパク質をビーズの上に流します。ここでは、ヒトS 100カルシウム結合タンパク質Bを使用します。3分ごとに溶液をゆっくりと5回ピペッティングし、合計15分間行います。15分後、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。最後に、セレクションバッファー 400 µL を加え、ピペッティングで3回優しく混ぜることで、ビーズに結合した S 100 B を洗浄します。再度、ビーズを遠心分離し、上清を捨てます。S 100 B結合abersを選択するため、この工程を2回繰り返し、計3回の最終洗浄を行います。 previouslyに取り分けておいた32 plusおよび30 plusフラグメントを回収します。これらのフラグメントをビーズ結合S 100 Bに添加します。その後、サンプルを15分間インキュベートします。15分後、3分ごとにピペッティングで穏やかに混ぜ合わせ、ビーズを短時間遠心して上清を除去します。次に、800 µLのセレクションバッファーを用いて、ピペッティングで穏やかにS 100 BDNA複合体を洗浄します。その後、ビーズを遠心し、上清を除去します。この洗浄工程を2回繰り返します。S 100を回収するために、20 millimolar tris, HCL pH 7.4を200 microliters、ビーズに加えます。その後、スラリーを85 degrees Celsiusで3分間加熱します。インキュベーション後、ビーズを1分間ボルテックスし、遠心分離して沈殿させます。その後、上清を新しいチューブに移します。この手順をもう一度繰り返し、得られた上清を合わせます。最後に、選択したDNA断片を精製します。PCR産物を、同量のフェノール・クロロホルムおよびイソプロピルアルコールで2回抽出します。250 mMの塩化ナトリウムおよび2.5倍量の100%エタノールを用いて、-70 °Cで15分間沈殿させます。4 °Cで21,000 GSにて15分間遠心分離します。その後、上清を捨てます。ペレットを75% ethanolで十分に洗浄します。4°Cで21,000 GSにて5分間遠心分離し、上清を捨てる。10回選択を行った後、ペレットをスピードバキュームで3分間乾燥させる。得られたPCR増幅DNA断片を、Vitrogen Coreから入手したPCR 2.1 topoベクターにクローニングする。次に、選択した N 30 cc および N 30 フラグメントについて、それぞれ 40 から 50 個のシングルコロニーを M 13 フォワードプライマーを用いてシーケンシングします。infomax vector NTI ソフトウェアを使用して、選択した配列をアラインメントします。その後、アラインメントに基づいてコンセンサス配列を決定します。コンセンサス配列が特定されたら、書面によるプロトコルに従ってコンセンサスアプタマーを購入します。5'末端にAmin C6基を持つ、合成された最初のアプタマーをプリンティングバッファーに懸濁し、最終濃度を15 micromolarにします。その後、Apogen Discoveries社のマイクログリッドアレイを用いて、アプタマー溶液をCodeLink活性化スライド上にスポットします。コードリンクで推奨されているプロトコルに従ってください。1枚のスライドに12個のアレイを配置して印刷してください。2×8のフォーマットを使用してください。ハイブリダイゼーション用のマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションカセット。S 100 Bタンパク質を70 µLのPBSで適切な濃度に希釈します。その後、その溶液をマイクロアレイカセットのウェルに適用します。蒸発を防ぐため、ヌクレアーゼフリーの粘着シール箔を用いてマイクロアレイカセットを密封します。コードリンク上にプリントされたabersにタンパク質を結合させます。室温で1時間インキュベーションした後、個別にスライドさせます。カセットのウェルを、5 mM 塩化マグネシウム含有PBSまたはPBSMで3回洗浄します。次に、蛍光標識した二次抗体をPBSM 70 µLを用いて0.125 µMに希釈します。この混合液を85 °Cで3分間加熱します。その後、ラベル化したABERSを氷上で冷却します。ABERSをマイクロアレイカセットのウェルに3分間適用します。再びカセットを粘着フォイルで密閉し、室温で1時間インキュベートします。再度、個別に処理します。洗浄後、ウェルをPBSMで3回洗浄してください。カセットを分解し、スライド全体をPBSMですすぎます。次に、遠心分離によってスライドを十分に乾燥させます。最後に、Packard Biosciences社のスキャンアレイを用いてスライドをスキャンします。$\gamma$ P$^{32}$ ATPで5'末端標識したアプタマーのS100Bタンパク質に対する4,000 XL結合量を測定し、K$_{D}$決定のために濃度に対してプロットしました。約7 roundsの選別後の代表的なKd値は、通常10⁻⁷ Mの範囲になります。5'末端にアミノ基を導入した第1アプタマーをCodeLinkマイクロアレイに結合させました。精製したS100Bタンパク質を第1アプタマーに結合させ、続いてLOR 546で標識した第2アプタマーをS100B-第1アプタマー複合体に結合させました。走査アレイスキャナーを用いて蛍光を定量しました。中段の行はサンドイッチ結合を示しており、上下の行のKDアッセイにおける相加的な結合によって特徴付けられます。abersの5'末端チオール誘導体についてはサンドイッチ結合は見られず、標準的なチオール化学を用いて金ナノワイヤに結合させました。同様の方法で、2番目の抗体を50 nMのまたは金ナノ粒子（gold nps）に結合させた。その後、精製したS 100 Bタンパク質をまず誘導体化ナノワイヤ上の第1アプタマーに結合させ、続いて50 nMの金ナノ粒子結合第2アプタマーを、第1アプタマー・ナノワイヤ・S 100 B複合体に結合させた。結合したサンドイッチ複合体は、FE-SEMを用いて可視化した。S 100 Bタンパク質の代わりにHTRA 1タンパク質を用いて実施した結合アッセイの陰性コントロールを確認できます。さて、この手順において最も重要な点の一つは、プライマーフリーのアプローチを採用していることです。これにより、固定配列が存在しないため、配列自体がランダム領域を圧倒することに起因する偽陽性や偽陰性の発生を防ぐことができます。この手順を行う際は、各逆転写反応の前にDNAテンプレートを確実に分解させること、および各再増幅後に特定のRT-PCR産物を慎重に単離させることが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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