ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

この手順の全体的な目標は、ランダムライブラリーからエーバーを同定することであり、これは標的タンパク質(この場合はS 100 Bタンパク質)に特異的に結合します。これは、まず制限エンドヌクレアーゼでライブラリを消化し、隣接する固定プライマー配列からランダム配列を遊離させることによって達成されます。手順の2番目のステップは、ランダムなライブラリ配列を精製されたS100 Bタンパク質に結合し、それらを回収することです。

手順の3番目のステップは、ハイブリダイゼーションとライゲーションによって、結合した配列を固定プライマー配列と再結合させることです。手順の最後のステップは、ライゲーションされた生成物を転写して、候補の結合したアバーズの結合プールの R-T-P-C-R 再増幅を可能にすることであり、その後、この選択手順の追加ラウンドが続きます。最終的には、選択されたABERのS 100 Bタンパク質への特異的結合を示す結果を得ることができる。

例えば、ここでは、サンドイッチ結合アッセイはマイクロアレイを用いて行われ、蛍光標識されたセカンドエイバーアッセイもまた、官能化ナノワイヤおよび15ナノメートルの金ナノ粒子に結合したセカンドエイバーを用いて行われる。今日は、D配列のランダムライブラリからS00Bタンパク質に結合するoptimalを選択する手順を示します。当研究室では、がんの早期発見のためのセンサープラットフォームの開発など、さまざまな目的でこの手法を利用しています。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、前述のようにプライマーフリーまたは PF DNA ライブラリーを作製します。二本鎖DNAライブラリーの切断とそれに続く10%変性ポリアクリルアミドゲルによるゲル精製により、30cc中に5つの主要なリン酸の32ヌクレオチドフラグメント、および30に5つの主要なリン酸の30ヌクレオチドフラグメントが生成され、それぞれ32プラスおよび30プラスフラグメントと呼ばれます。

32 plusフラグメントは、30ヌクレオチドランダムドメインを含み、3つのプライムエンドにCC最小隣接配列を持つのに対し、30 plusフラグメントは、30ヌクレオチドランダムドメイン配列のみで構成されています。PFライブラリーDNAフラグメントをaptr選択用に調製するには、32 plusおよび30 plusフラグメントのそれぞれを40 μLの20 milli tris(HCL pH 7.4)に懸濁します。その後、インキュベーション後、サンプルを摂氏85度で3分間加熱します。

冷却し、サンプルを摂氏37度のウォーターバスインキュベーターで3分間下ろし、次に760マイクロリットルの選択で、緩衝し、摂氏37度で3分間インキュベートします。3分後、サンプルを室温で10分間保持します。インキュベーション後、選択バッファーで事前に洗浄したニッケルNTAアグロビーズを含むカラムに溶液を通します。

非特異的なDNAを除去するには、カラムに結合しないPFライブラリーDNAフラグメントを採取し、後で使用するために取っておきます。S 100 B結合ビーズを調製するには、まず400マイクロリットルのニッケルNDAビーズをマイクロ遠心分離機で3秒間回転させ、上清を捨てます。次に、ビーズを400マイクロリットルの結合緩衝液で、5回静かにピペッティングして洗浄します。

次に、ビーズをスピンダウンし、上清を捨てます。これを繰り返します。二度洗います。

次に、以前に精製された貧弱なヒスチジンタグ付きタンパク質をビーズ上に配置しました。ここで、ヒトS100カルシウム結合。プロテインBは、3分ごとに5回、合計15分間、溶液を穏やかにピペットで上下させます。

15分後、ビーズを回転させ、上清を捨てます。最後に、ビーズ結合したS 100 Bを400マイクロリットルの選択緩衝液で、3回上下に軽く撫でながら優しく洗浄します。再度、ビーズを回転させて下降し、上清を捨てます。

この手順を2回繰り返して、合計3回の最終洗浄を行い、S 100 Bバウンドエイバーを選択します。以前に取っておいた 32 plus と 30 plus のフラグメントを取得します。ビーズ結合したS 100 Bにフラグメントを添加し、サンプルを15分間インキュベートします。

15分後に静かにピペッティングして3分ごとに混合し、ビーズを短時間スピンダウンし、上清を廃棄した後、静かにピペッティングしてS 100 BDNA複合体を800マイクロリットルの選択緩衝液で洗浄します。次に、ビーズを回転させて上清を捨てます。この洗浄手順を2回繰り返します。

S100を回収するには、ビーズに20ミリモルトリス、HCL pH 7.4の200マイクロリットルでエイバーを選抜する。次に、スラリーを摂氏85度で3分間加熱します。インキュベーション後。

ビーズを1分間渦巻き、回転させます。次に、上清を新しいチューブに移します。この手順を一度繰り返して、上清を結合します。

最後に、選択したDNAフラグメントを精製します。同量のフェニルクロロホルム、イソプロピルアルコールでPCR産物を2回抽出します。250ミリモルの塩化ナトリウムと100%エタノールの2.5倍の容量で、摂氏マイナス70度で15分間沈殿させます。

摂氏 4 度で 21, 000 GS で 15 分間スピンダウンします。次に、上清を捨てます。ペレットを75%エタノールで効率的にすすいでください。

摂氏4度で21, 000 GSで5分間スピンダウンし、上清を捨てます。ペレットをスピードバキュームで3分間乾燥させます 10ラウンドの選択後。得られたPCR増幅されたDNA断片を、ビトロジェンコアから得られたPCR 2.1トポベクターにクローニングします。

次に、選択したN 30 ccおよびN 30フラグメントのそれぞれについて、40〜50の単一コロニーをM 13フォワードプライマーでシーケンシングします。infomax vector NTIソフトウェアを使用して、選択した配列をアライメントします。次に、アラインメントに基づいてコンセンサス配列を決定します。

コンセンサス配列が特定されたら、書面によるプロトコルに記載されているようにコンセンサスエーバーを購入します。印刷バッファー中の5素アミンC6部分で合成された最初のアプタマーを、最終濃度15マイクロモルまで懸濁します。次に、アポゲン発見マイクログリッドアレイを使用して、コードリンク活性化スライドにアプタマーソリューションを見つけます。

次のコード リンク推奨プロトコル。各スライドを 12 個の配列で印刷します。2 x 8 形式を使用します。

ハイブリダイゼーション用のマイクロアレイハイブリダイゼーションカセット。S 100 Bタンパク質を70マイクロリットルのPBSで適切な濃度に希釈します。次に、溶液をマイクロアレイカセットのウェルに適用します。

マイクロアレイカセットは、ヌクレアーゼフリーの接着性天井ホイルを使用してシールし、蒸発を防ぎます。コードリンクに印刷されたアバーにタンパク質が結合するのを待ちます。インキュベート後、室温で1時間スライドさせてください。

カセットのウェルをPBS、5ミリモル塩化マグネシウム、またはPBSMで3回洗浄します。次に、蛍光標識された第2のエイバーを70マイクロリットルのPBSMで0.125マイクロモルに希釈します。混合物を摂氏85度で3分間加熱します。

次に、ラベル付けされたABERSを氷の上で冷まします。3分間、アブをマイクロアレイカセットのウェルに塗布します。再度、カセットを接着ホイルで密封し、室温で1時間インキュベートします。

再び、個別に。洗浄後、PBSMでウェルを3回洗浄します。カセットを分解し、スライド全体をPBSMですすいでください。

その後、遠心分離によりスライドを完全に乾燥させます。最後に、スキャン型Packard Biosciencesのスキャンアレイを使用してスライドをスキャンします。4, 000 XL結合は、ガンマP 32 A TPの5プライムエンド標識アプタマーをS 100 Bタンパク質に測定し、KD測定のための濃度に対してプロットしました。

約 7 ラウンドの選択後の代表的な kds は、通常、10 から負の 7 モルの範囲です。5つの主要な照準dert最初のアプタマーは、コードリンクマイクロアレイに結合され、精製されたS 100 Bタンパク質は、最初のオプティマーに結合され、LOR5 46は、2番目に標識されました。オプティマーは最初のオプティマー S 100 B コンプレックスに縛られていた。

蛍光は、スキャンアレイスキャナーを使用して定量しました。中央の行は、上下の列のKDアッセイにおける相加法的結合を特徴とするサンドイッチ結合枯れを示しています。5つのプライムチオール誘導体化された最初のエイバーは、標準的なシール化学を使用して金ナノワイヤーに結合されました。

セカンド・エイバーは、同じ方法で50 NMOまたは金のnpsに結合されました。次に、精製されたS100Bタンパク質を最初に誘導体ナノワイヤーに結合させ、次に2番目のアプタマー50ナノモル金mpsを最初のアプタマーナノワイヤーS100B複合体に結合させました。結合したサンドイッチ複合体は、F FE SEMを使用して視覚化しました。ここは。

S 100 Bタンパク質の代わりにHTRA oneタンパク質を用いて実施された結合アッセイでは、ネガティブコントロールが見られます。さて、この手順で最も重要なことの1つは、プライマーフリーのアプローチを使用しており、偽陽性や偽陰性を引き起こす可能性のある固定配列がないため、配列自体がランダム領域を圧倒していることです。この手順を行う際には、各逆転写反応の前にDNAテンプレートが破壊されていることを確認し、各再増幅後に特定のR-T-P-C-R産物を単離するよう注意することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。