Name: 細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ植物細胞壁のオリゴマスプロファイリング（OLIMP）法。酵素分解とMALDI-TOF質量分析を組み合わせて、細胞外マトリックスの多糖類構造を迅速かつ高感度に解析します。

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この作品は、エネルギーバイオサイエンス研究所の助成金OO0G01によって賄われていた。

オリンプメソッドはglycosylhydrolaseとしてエンドグルカナーゼを用いて、双子葉植物、キシログルカンの細胞壁に存在する主要なヘミセルロースに例示される。方法は、植物組織の源としての全体シロイヌナズナ実生を用いて実証されています。酵素と細胞外マトリックス材料は、同じ手順を用いて所望の分析に応じて置換することができます。 1。細胞壁の分離<ol><li>収穫5人が、5日齢全体シロイヌナズナの苗や、ご希望の材料の相当額と1.5mlの反応管に移す。材料は、チューブの底部に配置されていることを確認します。 </li><li>液体窒素でのサンプルとスナップ凍結の上に反応管に2つ3ミリメートルの金属のボールを追加。 </li><li>ボールミル（2:30分、25Hzの）を使用して凍結サンプルを挽く。 </li><li>サンプルに1mLの70％水性エタノールを加えます。磁石を用いて金属球を取り外します。徹底的にボルテックス。 </li><li>ペレットに10分細胞壁物質を含有するアルコール不溶性残渣を14,000 rpmでサンプルを遠心分離します。 </li><li>慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。 </li><li>クロロホルム/メタノール（1:1 v / v）溶液1mLの追加。ペレットを再懸濁させる徹底的にボルテックス。 </li><li> 10分間14,000 rpmでサンプルを遠心し、慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。 </li><li>コンセントレータを使用してサンプルを乾燥させる。 </li></ol> 2。オリゴ糖の可溶化<ol><li>可溶化のために、そのオリゴ糖の形で特定の多糖類は、適切なバッファーの25μlのに乾燥したペレットを再懸濁します。エンドグルカナーゼ50mmのギ酸アンモニウム、pH4.5の場合は、使用されています。エンドグルカナーゼの0.2Uを追加。ダウン渦サスペンションとスピン液体。 </li><li> 37℃で16時間サンプルをインキュベート° Cのインキュベーターで、300rpmで振盪。 </li><li>コンセントレータを使用してダイジェスト（水）の溶剤を削除します。 </li></ol> 3。放出オリゴ糖のMALDI - TOF分析<ol><li> BioRex MSZ 501陽イオン交換樹脂ビーズは、消化サンプルから塩と酵素を除去するために使用されています。空のカラムに一定量を配置し、多量の水でビーズを洗浄することにより条件ビーズを。 </li><li>消化し、乾燥サンプルに5〜10 BioRexビーズを追加。その後、水の材料の5μlの少量を使用することができるために、10μlの水を加えます。簡単にチューブを回転させて、溶液中のビーズを浸す。室温で少なくとも10分間インキュベートする。 </li><li> MALDIターゲットプレートにスポット2μlのマトリックス（2,5 - ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、水で10mg/ml）。均一なマトリックスの化学物質の結晶につながる真空下で溶媒マトリックスを蒸発させる。 </li><li>ターゲットプレート上にマトリックスの結晶の上に脱塩試料溶液のスポット2μlの。 あなたが多数のサンプルを発見する場合のみ3分の最高のためにスポッティング続ける。この時間枠は、最初に斑点を付けられたサンプルがまだ乾燥していないことを保証します。最後の斑点のあるサンプルに再溶解し、マトリックスとサンプル糖鎖分子の完全な混合を確実にするために追加の2分間待ちます。その後、真空下でターゲットプレートを乾燥させる。 サンプル/マトリックス混合は、均質な結晶化を有効にするために1分も経たないうちに結晶化する必要があります。 </li><li> MALDI - TOF質量分析計への場所のターゲットプレート。マシンは、20000Vと350nmの遅延の加速電圧と正のリフレクトロンモードに設定する必要があり、選択されている質量範囲500から3000ダ（予想されるオリゴマーに依存して変更される可能性がある）はずです。レーザーを発射起動し、代表的な平均のスペクトル（図2A）を生成するためにコンパイルされているサンプル当たり100から200のスペクトルを、収集する。特定のオリゴ糖を表すイオンが電荷（m / z）比を、その質量によって識別することができます。関心のあるすべてのイオンのイオン強度（ピーク高さ）サンプル中の各オリゴ糖の相対量（図2B）、結果として100％まで追加する必要があります。 </li></ol> （4） その場オリンプの分析では オリンプは、任意の壁の準備手順を省略する組織に直接使用することができます。例として、植物組織の源としてシロイヌナズナの黄化胚軸が使用されます。再び、エンドグルカナーゼは、ヘミセルロースのキシログルカンの構造を決定するために使用されます。酵素と組織の材料は、同じ手順を用いて所望の分析に応じて置換することができます。 <ol><li>黄化苗を収穫し、空のMALDIターゲットプレート上に置き、苗を乾燥させて。 </li><li>所望の位置に乾燥させた苗を0.5μlエンドグルカナーゼを（50mmのギ酸アンモニウムに溶解0.4U/μl、、pH4.5）を追加します。酵素の低下が部分的にターゲットプレートに触れていることを確認してください。 </li><li>その酵素ドロップが乾燥を避けるために、飽和湿度で密閉容器にMALDIターゲットプレートを置きます。 1のチャンバー内にプレートをインキュベート37 6H℃、 </li><li>植物組織および真空下で酵素のドロップとMALDIターゲットプレートを乾燥させます。 </li><li>各乾燥酵素のスポットの上に、0.5μlの行列を（10mgの/ L DHB）を追加します。それが2分間放置する。 </li><li>真空下MALDIターゲットプレートを乾燥させます。 </li><li> MALDI - TOFのサンプルを分析する。 MALDI - TOF質量分析計への組織および酵素/マトリックススポット（複数可）でターゲット板を配置。マシンは、20000Vと350nmの遅延の加速電圧と正のリフレクトロンモードに設定する必要があり、選択されている質量範囲500から3000ダ（予想されるオリゴマーに依存して変更される可能性がある）はずです。 </li><li>組織へNEXTマトリックス/試料結​​晶にレーザーを発射開始。あなたのような分子のフライトの時はoffとなるような場合には、組織自体に該当していないことを確認してください。代表的な平均のスペクトル（図3）を生成するためにコンパイルされているスポット、当たり20から50前後のスペクトルを収集する。特定のオリゴ糖を表すイオンが電荷（m / z）比を、その質量によって識別することができます。イオン強度（イオンの高さ）が報告することができ、関心のすべてのイオンは試料中の各オリゴ糖の相対量で、その結果100％まで追加する必要があります。 </li></ol> 5。代表的な結果 シロイヌナズナ実生におけるヘミセルロースのキシログルカンの存在のオリンプ分析の例を図2に示されています。イオンの質量差と知られて十分に特徴付けられた酵素（エンドグルカナーゼ）特異性に起因するイオンは、特定のオリゴ糖の構造（図2A）に割り当てることができます。明らかに、構造異性体を区​​別することができます。様々なオリゴ糖の相対量の決定のための基本的な前提は、（図2B）、その質量分析の応答係数は、それらのオリゴ糖のために非常に似ていることです。ここに示すように、オリンプ定量化は非常に再現性です。しかし、メソッドの堅牢性は、様々なオリゴ糖のイオン対雑音比信号に大きく依存していることに注意してください。例えば塩またはオリゴ糖のより少量の混入は、その比率を減らすことができます。 組織自体のオリンプ分析は、（その場分析で）非常に小さいと定義されている領域の研究を可能にし、非常に少ないサンプル調製を含む。例では、定性的（同じイオン）（図3）ここで紹介しませんが、定量的な違いは、（イオン強度のばらつき） シロイヌナズナ実生の茎と根組織の間で観察された。オリンプ法の順列は、このように組織、"イメージング"につながる可能性があります。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1植物源として全体シロイヌナズナの苗を使用してオリンプ手順のフローチャート。最初に、組織が ​​漬けられ、細胞壁の材料は（写真は藤野らから変更。10）用意されています。その後、特定の壁の多糖類のオリゴ糖は、特定の加水分解酵素を使用して解放されています。最後に、水溶性オリゴ糖の相対的存在量をMALDI - TOF質量分析法を用いて決定されます。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。オリンプにより決定されたシロイヌナズナから黄化実生におけるキシログルカンのオリゴ糖の相対的な量。 A）代表キシログルカンオリゴ糖質量スペクトルを、それぞれのイオンは、特定の糖鎖構造を表し、構造異性体を区​​別することができます。相対的なオリゴ糖豊富な測定のためのB）対応するバーの図。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。例として、 シロイヌナズナの黄化実生を用いてその場オリンプの分析では 。それぞれの酵素/消化液滴（色付きの丸）が独立して分析することができ、対応するマススペクトルが得られ、分析することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> キシラナーゼ（Megazyme）とススキの葉の材料を消化し ​​て得られたヘミセルロースのキシランの図4。オリンプスペクトル。

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利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するオリンプ方法は、細胞外マトリックスに存在するポリマーの非常に敏感かつ迅速な分析が可能になります。オリンプは、後続のMALDI - TOF分析とオリゴマーの酵素的放出を兼ね備えています。 MALDI - TOFスペクトルの生成は、1分未満を受け取り、それ故にオリンプは、このような変異体の画面のようなハイスループット試験を含む広範囲のアプリケーションに適しています。オリンプは、植物の多糖類に限定されるものではなく、潜在的にのみ特異的加水分解酵素の利用可能性によって制限ポリマー、の広い範囲に適用することができます。しかし、オリンプの制限は、ポリマーの絶対的な豊かさが得られないということです。 オリンプが種の多様性の細胞外マトリックスに存在する多糖類の様々の構造を研究するために使用する前に、前述のとおり。例として、図4は、草種の主要なヘミセルロース、キシランのオリンプスペクトルを表しています。ここでは、温帯草ススキ由来の細胞壁の材料は、キシラナーゼを用いて消化した。

<table><tbody><tr><td>2,5-ジヒドロキシ安息香酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10mg/mL in water</td></tr><tr><td>BioRex MSZ 501(D) レジン</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>エンドグルカナーゼ</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>キシラナーゼ M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>3mm 金属ボール</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>ビーズミル</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>株式会社島津製作所</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>MALDI ターゲットプレート</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>真空マニホールド</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

環境への細胞の直接接触は、細胞外マトリックスによって多くの生物に仲介されている。細胞外マトリックスの一つの一般的な側面は、彼らは複雑な糖の糖タンパク質の形で部分、プロテオグリカン、および/または多糖類を含んでいるということです。例としては、繊維状のタンパク質およびプロテオグリカンや植物と菌類の多糖類ベースの細胞壁を主とする人間と動物細胞の細胞外マトリックス、プロテオグリカン/細菌の糖脂質ベースの細胞壁が含まれています。すべてのこれらのglycostructuresは、細胞間および細胞 - 環境コミュニケーションとシグナル伝達において重要な役割を果たしている。 細胞外マトリックスの異常な複雑な例では、高等植物の細胞壁に存在しています。その壁は、最大75％乾燥重量に、糖からほとんど完全に成って、そしてこの地球上に存在する最も豊富に存在する生体高分子から構成されています。したがって、研究は化石燃料から得られる石油化学製品を置き換えるために、カーボンニュートラルな再生可能資源として最適なこれらの材料を活用する方法を実施しています。燃料転換のための主な課題は、このユニークなbiocompositeに存在するユニークなglycostructuresによる酵素的または化学的劣化に壁の反抗のまま。 ここで、我々は、植物細胞壁のglycostructuresの迅速かつ高感度分析法を提示する。このメソッドオリゴマスプロファイリング（オリンプは）特定のglycosylhydrolasesとマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MSを用いて可溶化したオリゴ糖混合物のその後の分析を容易にする壁材料からのオリゴ糖の酵素のリリースをベースにしています1）（図1）。オリンプは、完全な分析のためにのみ5000細胞の壁は、組織自体が2で実行できる必要があり、ハイスループット分析3に従順です。可溶化されたオリゴ糖の絶対量がオリンプによって決定することはできませんが、様々なオリゴ糖のイオンの相対量は、壁に存在する天然多糖の置換パターンについての洞察を与えるマススペクトルから線引きすることができます。 オリンプは、特定の酵素4の可用性によって制限壁ポリマー、多種多様な分析をするために使用することができます。例えば、植物細胞壁の酵素に存在するポリマーの分析のためにエンド -β-（1-4）-キシラナーゼ6,7を使用してキシログルカナーゼ5、11、12、13、キシランを用いたヘミセルロースのキシログルカンを分析するために用意されています、またはポリガラクツロナーゼおよびメチルエステラーゼ8の組み合わせを使用して、ペクチン多糖類のため。さらに、オリンプglycosylhydrolaseとさえ糖転移酵素活性のと同じ原理を使用しては監視し、9を決定することができます。

迅速な方法は、細胞外マトリックス中の多糖類の構造についての洞察を得るために説明されています。方法はglycosylhydrolasesの特異性と材料の微量を分析できるように質量分析の感度を利用しています。この手法は、組織自体に直接使用するための適応です。

多くの生物において、細胞と環境との直接的な接触は細胞外マトリックスによって媒介されています。細胞外マトリックスに共通する一つの側面は、...

ここで示すオリゴ糖質量プロファイリング（Olympic実験）により、生物の細胞外マトリックスまたは細胞壁におけるポリマー構造に関する迅速な知見を得ることができます。本事例では、まず70% ethanolを用いて細胞成分を除去することで、植物の苗から細胞壁を調製します。次に、標的となる細胞壁ポリマーを特異的なヒドロラーゼで消化し、特定の細胞壁成分をオリゴ糖の形態で可溶化させます。別の手法として、組織上で直接、Ctwoの酵素を用いて細胞壁を消化する方法があります。放出されたリガメントの相対的な量は、MALDI質量分析および統計解析によって決定されます。こんにちは、カリフォルニア大学バークレー校エネルギーバイオサイエンス研究所のMarcus Pollyです。こんにちは、マーカス・リーです。そして、アシャ・ギラーです。共にエネルギーバイオサイエンス研究所に所属しています。生物は細胞外マトリックスに囲まれており、それは生物種によって異なりますが、複雑なポリマーネットワークで構成されています。細胞外マトリックスを迅速かつ感度高く評価する方法として、本日は「oli mass profiling」（short oleum）と呼ぶ手法をご紹介します。この手順は植物組織に直接適用することも可能です。それでは、始めていきましょう。まず、植物組織から細胞外マトリックスまたは細胞壁を単離することから本手順を開始します。5本のシロイヌナズナの苗、または同量の他の植物材料を採取し、1.5 mL反応チューブに移します。材料がチューブの底に配置されていることを確認してください。3 mmのメタルボール2個を反応チューブに加え、液体窒素で急速凍結させます。次に、ボールミルを用いて、25 Hzで2.5分間、凍結サンプルを粉砕します。材料の粉砕後、サンプルに70%エタノール水溶液を1 mL加えます。磁石を用いてメタルボールを取り除き、十分にボルテックスします。この処理により、ほとんどのタンパク質と細胞小器官が可溶化されます。サンプルを14,000 RPMで10分間遠心分離し、細胞壁材料に相当するアルコール不溶性残渣をペレット化します。ペレットを乱さないように注意しながら、上澄み液を慎重に吸引します。チューブに残っているペレットに、クロロホルム・メタノール溶液を1 mL加え、ボルテックスで十分に攪拌します。ペレットを再懸濁させた後、遠心分離を行います。クロロホルム・メタノールは、脂質などの疎水性化合物を抽出します。遠心分離後、上清を除去し、真空遠心機を用いてペレットを完全に乾燥させます。これで細胞壁材料の単離が完了し、特定のリガンドを得るための処理が可能になります。ここで実演するのは、シロイヌナズナなどの双子葉植物の細胞壁に多く含まれるヘミセルロースであるXlo glucanの可溶化です。Xlo glucanは、他の糖残基が高度に置換されたグルカン主鎖からなるポリマーです。このポリマーを可溶化するために、真菌由来のエンドグルカナーゼを使用します。乾燥させて単離した細胞壁ペレットを25 µLの50 mMギ酸アンモニウム（pH 4.5）に再懸濁し、0.2 Uのエンドグルカナーゼを加えます。懸濁液をボルテックスして混合し、遠心分離で液を回収します。チューブをミキサーに入れ、37 °Cで振盪しながら16時間、細胞壁を消化させます。振盪速度は300 RPMとします。単離した細胞壁の消化が完了したら、真空遠心機を用いて溶媒を除去し、放出されたオリゴ糖を質量分析で分析します。なお、消化後のサンプルから塩および酵素を除去するには、Biox MSD 5 0 1の陽イオン交換樹脂ビーズを使用します。まず、必要な量のビーズを空のカラムに入れ、大量の水で洗浄してコンディショニングを行います。消化して乾燥させたサンプルに、コンディショニング済みのbioxカチオンビーズを5〜10個加えます。その後、試料量が少ない場合は、水10 µLを加えます。5 µLの水を使用することができます。チューブを短時間遠心してビーズを溶液に浸し、ダイジェストをビーズと共にインキュベートしている間、室温で少なくとも10分間インキュベートします。MALDIターゲットプレートに2 µLのDHBマトリックスをスポットします。真空下でマトリックス溶媒を蒸発させ、マトリックスの化学結晶を形成させます。次に、ターゲットプレート上のマトリックス結晶の上に、脱塩済みダイジェスト溶液を 2 µL スポットします。サンプルマトリックススポットの溶媒を、再度真空下で蒸発させます。付属の書面プロトコルに詳しく記載されている通り、結晶化させる前にサンプルマトリックス溶液を適切に混合する時間を維持することが重要です。サンプルが乾燥したら、ターゲットプレートをMALDI質量分析計にセットします。装置をポジティブモードに設定し、加速電圧を20,000 volts、ディレイを350 nanometersに設定してください。これらのヘミセルロースリガメントに選択した質量範囲は 500 から 3000 Daltons です。質量範囲は、想定されるリガメントのサイズに応じて調整してください。レーザー照射を開始し、サンプルあたり 100 から 200 個のスペクトルを収集して、代表的な平均スペクトルを生成するために集計します。これはヘミセルロースのolyスペクトルです。このビデオで実演しているoly法は、細胞壁の調製ステップを省略して、植物組織に直接適用することも可能です。このin situ解析の手順を、暗所育成したシロイヌナズナの苗を用いて実演します。検体をターゲットプレート上に直接配置し、プレート上の苗が乾燥するまで風乾させます。適切な酵素バッファーミックス 0.5 µL を目的の位置に加えます。酵素の液滴が組織とターゲットプレートの両方に部分的に接触していることを確認してください。酵素液滴の乾燥を防ぐため、MALDIターゲットプレートを飽和湿度に保った密閉容器に入れます。プレートを37°Cで16時間インキュベートします。インキュベーション期間の終了後、真空状態で酵素スポットを乾燥させ、各乾燥酵素スポットの上に0.5 µLの液体DHBマトリックスを添加します。次に、MALDIターゲットプレートを真空下で乾燥させます。NCの2つのサンプルを分析するため、組織検体と酵素マトリックススポットを含むターゲットプレートをマルチトープ質量分析計にセットし、単離した細胞壁サンプルと同じ設定を用いて質量スペクトルを記録します。マトリックスへのレーザー照射を開始します。組織の隣にあるサンプル結晶をサンプリングしてください。組織自体に照射しないよう注意してください。組織に当たった場合、分子の飛行時間がずれてしまいます。1スポットあたり約20〜50個のスペクトルを収集し、それらを統合して代表的な平均スペクトルを作成します。これは、AOPsに存在するHemosILグルカン由来のオリゴ糖の代表的な平均スペクトルです。関心のあるすべてのイオンの強度またはピーク高さを合計して100%とし、各種オリゴ糖の相対存在量を算出します。NC two OMP法の結果からも、同様の結果が得られます。色付きの円でマークされた各酵素消化ドロップレットを独立して解析でき、対応する質量スペクトルを取得して解析することが可能です。また、適切な加水分解酵素が利用可能であれば、細胞外マトリックスの他のポリマーに対してもOolaを実施できます。例として、これはバイオエネルギー作物に存在するhemo cellulose cylinのoolaスペクトルです。mecampusの葉から得た材料をxinで消化し、提示されたデータを取得しました。イオンの構造割り当てについては、付属のプロトコルを参照してください。以上が、exo cellular metricsにおけるオリゴマーの質量プロファイリングの手順です。この手順を行う際は、OV MS分析において均質なマトリックス結果が得られたときに最良の結果が得られることを覚えておくことが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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生物学

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

出典: Hu, Y. ら。In vitro bath 発酵システムを用いてエンドバイオティクスとヒト腸内細菌叢の相互作用の解析。 J. Vis. Exp.

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膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

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学ぶ植物細胞壁のオリゴマスプロファイリング（OLIMP）法。酵素分解とMALDI-TOF質量分析を組み合わせて、細胞外マトリックスの多糖類構造を迅速かつ高感度に解析します。

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

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