フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Cal Painsは、シグナル伝達、細胞骨格リモデリング、遺伝子発現の調節、アポトーシス、細胞周期の進行など、多くの生理学的プロセスで重要な役割を果たす、ユビキタスな細胞内カルシウム感受性中性システインプロテアーゼであり、固定細胞および生細胞のカルパイン活性を測定するために、蛍光基質BUC、LMC MACが追加されます。Buc LMC MACはカルパインによって特異的に切断されるため、蛍光が増加します。蛍光の変化はフローサイトメトリーによってモニターされ、30の2Dキット細胞で正常な細胞と比較してcal疼痛活性が増加していることが明らかになります。

こんにちは、私はトロント大学の免疫学部および大学健康ネットワークのスチュワート・バーガー博士の研究室のクリスティーナ・ファーです。今日は、フローサイトメトリーベースのアッセイを使用して、固定細胞と生細胞のcal疼痛活動を測定する方法をご紹介します。私たちの研究室では、このアッセイを使用して、白血病およびリンパ腫細胞のcal疼痛活性を調べています。

それでは始めましょう。実験を開始する前に、検出試薬1%PARAFORMアルデヒドcal疼痛抑制剤PD 1 50 0 6 0 6、MEC one阻害剤PD 9 8 0 5 9などの必要な試薬を準備してください。これらの試薬の調製の詳細については、添付の書面によるプロトコルEloqua 1 milliliter of 1%para formaldehyde to each fax tubesをご覧ください。

このビデオに示されている固定細胞の実験条件ごとに3本のファックス管が必要です。3 つの条件がテストされるため、9 本のファックス管が必要です。最適な培地で成長させたミリリットルあたり6個の細胞のうち10倍から0.5倍から1倍の32個のDKI細胞から始めます。

ウシ胎児血清、IL、3つの腫瘍、カプトエタノール、および抗生物質を補給。6つのセルに10の4倍を3本の15ミリリットルのファルコンチューブのそれぞれに移します。チューブを遠心分離機に入れ、摂氏15度で225Gで5分間回転させてペレット

遠心分離機の薬剤に続いて、スナットを吸引し、室温の2ミリリットルで細胞を再懸濁し、PBSは50マイクロモルのcal疼痛阻害剤PD1、50、0、6、0、6で1つの細胞懸濁液を処理します。チューブをアルミホイルで覆うことにより、サンプルが光から保護されていることを確認してください。ボルテックス その後、暗闇の中で室温で20〜30分間インキュベー

2番目の細胞懸濁液を20マイクロモルのme one inhibitor PD 9 0 5 9で処理します。細胞を35mmの組織培養皿に播種し、サンプルをインキュベートしている間に摂氏37度で2時間インキュベートします。未処理のサンプルでcal Calpainアッセイを開始します。

まず、細胞懸濁液に2ミリリットルの検出試薬を添加します。直ちに、1ミリリットルの細胞懸濁検出試薬混合物を事前に調製したファックスチューブに加えて、Tがゼロに等しいサンプルを生成します。細胞懸濁液を検出試薬と5分間インキュベートします。

室温で、1ミリリットルの細胞懸濁検出試薬混合物を、1ミリリットルの1%パラホルムアルデヒドを含む、事前に調製したファックスチューブに加えて、Tが5サンプルに等しいものを生成します。残りの細胞懸濁液を検出混合物と共に室温でさらに5分間インキュベートします。5分後、細胞懸濁液の別の1ミリリットルを、1ミリリットルの1%パラホルムアルデヒドを含む調製されたファックスチューブに移します。

これは T が 10 分の時点に相当します。次に、阻害剤で処理した30個の2Dキット細胞に対してcalペインアッセイを繰り返します。ラックをアルミホイルで覆います。

翌日、暗所で細胞を摂氏4度で一晩固定します。細胞を725Gで15°Cで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。スピン吸引後、上清を750マイクロリットルのPBSに細胞を再懸濁します。

細胞を氷の上に置き、フローサイトメトリーを行うまで暗所に置いておきます。ここは。データ取得は、固定セルについて実証されています。LSR 2を使用してフローサイトメトリーを実行します。

光波ex励起またはUVレーザー励起ラインのフィルターを355ナノメートルに設定し、レーザー出力を25ミリワットに設定し、基板と製品にそれぞれ405ナノメートルと450ナノメートルの発光を設定します。基板と製品に使用されるBAMパスフィルターは、20と450よりも405である必要があります。基板と製品用の50を超えるロングパスフィルターは、405と450である必要があります。

PMT電圧を基板は350〜375、製品は325〜350に設定します。次のパラメーターを使用して、BD FAX diva の実験を設定します。前方散乱、側散乱、インド、対数スケールを使用して1つの青、1つの紫

また、ワークシートの対数スケールを使用します。次のグラフを設定します。生細胞上のゲートを使用した前方散布図と側面散布図。

Indo One Blue Histogram、Indo One Violet Histogram、Indo One Blue対Indo One Violetドットプロットは、ラインフローとラインフローと蛍光ビーズでLSR 2を較正します。PMT電圧は、各実験の前にビーズ蛍光ヒストグラムのピークを同じチャンネルに配置するように調整する必要があります。0 分時点から 30 個の 2D キットセルを使用してデータの取得を開始します。

パラメータボリュームを調整しますtage必要に応じて。サンプルごとに 10, 000 のイベントを取得して記録します。マシンをファックスバッファーですすぎ、サンプルごとに取得を繰り返します。

データ取得後にデータをエクスポートします。LSR 2が研究所のガイドラインに従って清掃されていることを確認してください。細胞懸濁液は、検出試薬やcal疼痛抑制剤を添加せずに、以前と同様に調製します。

サンプルをLSR 2に持って行き、前と同じようにフィルターとパラメーターを設定します。前と同じようにワークシートを設定します。インド 1 つの青と時間を示す大きなドット プロットを含めます。

最大数のイベントを取得するようにプログラムを設定します。ストップゲートはありません。50マイクロモルのcal疼痛阻害剤を32Gキット細胞の1つの細胞懸濁液に加えます。

サンプルを暗所に保管し、細胞がインキュベートしている間に室温で20〜30分間インキュベートします。cal pain inhibitor を使用しない 30 2D キット細胞懸濁液に関するデータの取得を開始します。毎秒200〜300イベントの低流量を使用します。

30秒から1分後、チューブを機械から取り外します。20マイクロモルのBach LMC macを細胞に加えます。これが検出試薬です。

それはカルパインによって特異的に切断され、その切断は基質蛍光渦の増加をもたらします。その後、データの取得を続けます。10〜20分間、またはcalの痛みの活動が頭打ちになるまでデータを取得します。

次に、cal pain inhibitorで処理した32個のgki細胞で取得を繰り返します。終了したら、分析のためにデータをエクスポートします。混合細胞アッセイは、マウスの脾臓から生成された細胞懸濁液で開始します。

各細胞懸濁液を2つに分けます。1つの細胞懸濁液を50マイクロモルのcal疼痛抑制剤で処理し、ホイルで覆い、暗所で室温で20〜30分間インキュベートします。固定細胞について前述したようにカルパインアッセイを行った後、チューブをホイルで覆い、暗所で細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、725Gで摂氏15度で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を500マイクロリットルのPBSで洗浄し、上清を再度吸引し、細胞を200マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁し、2%BSAで室温で15分間インキュベートします。次に、ここで一次抗体であるZI anti-USを調製します。

CD one 17は、最終希釈が1〜200となるような染色緩衝液中で調製される。抗体が暗所に保管されていることを確認してください。200 μLの一次抗体を細胞に加え、暗所で室温で30分間インキュベー

次に、400マイクロリットルのPBSを追加して、フローサイトメトリーの容量を増やします。細胞を氷の上に置き、暗所に保管します。固定細胞について示したのと同じフローサイトメトリー手順を使用してデータを取得します。

ZIをパラメータに追加し、フローサイトメーターでデータを取得した後のワークシートにZIのヒストグラムを含めます。FlowJo gaitを使用して、前方および内部散乱プロファイルに基づいて生細胞で分析します。生細胞ゲートからのIndo Blueの平均蛍光を測定します。

このプロットでは、赤線は0分での平均基板蛍光を示し、青線と緑線は5分と10分での平均基板蛍光を示しています。混合細胞集団については、ヒストグラムとドットプロットでFXI蛍光を使用して、30個の2D kip集団を同定します。30個の2D kip集団のエンドブルーの平均蛍光を決定します。

最後に、Microsoft Excelを使用して平均蛍光をグラフ化します。5分から10分の間の線の傾きを計算します。傾きを棒グラフとしてグラフ化し、細胞内の疼痛活動を決定します。

ここに示すデータは、30個の2D細胞が高レベルのcal pain活性を持ち、cal pain活性がMEK阻害剤によって阻害される可能性があることを示しています。ここまで、固定細胞と生細胞におけるcalの痛みの活動を測定する方法をお見せしました。この手法を実行するときは、LSR 2を正しくセットアップし、蛍光ビーズを使用してマシンを校正することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。