キメラの生成のためのメダカ胚および細胞移植のDechorionation

ハード絨毛膜とソフト胚による、メダカ胚の操作は、ゼブラフィッシュにおけるよりも複雑です。このビデオでは、キメラの生産のためのイメージングと細胞移植のためにアガロースに取付け、dechorionation含むメダカ胚を操作する方法のためのステップバイステップの手順を示しています。これらの手順は、脊椎動物のゲノム機能の遺伝的解剖のためにそれらの補完的な機能をフルに活用するために実験室でのメダカとゼブラフィッシュを使用するために不可欠です。

この手順の全体的な目標は、目的の遺伝子またはタンパク質の自律性を調べる目的で、胚内でクローンを作成することです。これは、このビデオのコンパニオンであるMaka胚のマイクロインジェクションで示されているように、1つの細胞段階でマイクロインジェクションにより、ドナー胚をロッドドミンデキストランで標識することによって達成されます。手順の2番目のステップは、ドナーとレシピエントの両方の胚を正しい段階に成長させることです。

手順の3番目のステップは、ドナーとレシピエントの両方の胚をコーティングすることです。手順の最後のステップは、標識されたドナー胚からレシピエントの胚に細胞を移植することです。最終的には、移植された細胞の蛍光または系統トレーサーによって移植された細胞を検出することにより、クローンの分布、増殖、分化を分析することにより、結果を得ることができます。

こんにちは、バース大学生物学・生化学部のマコト・フキ博士の研究室のショーン・ブラジンスキーです。私もゼキ研究室のワンです。今日は、ダークフィッシュの胚に細胞移植する手順をご紹介します。

私たちの研究室では、この手順を使用して、目的の遺伝子または突然変異、細胞または非細胞の自律機能を持つ研究を行っています。それでは始めましょう。マカエッグをコーティングするときは、無菌の溶液とツールを使用して、長期的な観察と培養の成功を高めます。

P 2000グリット防水サンドペーパーを9センチメートルの非粘着性シャーレの蓋に置きます。広い口を使用して磨かれたパスタピペットを発射し、卵の皿から最大10個の新しくクラスター化されていない、洗浄され、ラベル付けされた卵を移します。紙やすりに中程度。

余分な培地を取り除き、卵が乾燥しないように皿に十分な量を残します。手袋をはめた指先を使用して、一度に10個の卵をサンドペーパーの上で45〜60秒間そっと転がします。外面の毛を取り除き、コーリアン表面にスコアを付けるには、最小限の圧力を加え、指先をサンドペーパーと平行に保ちます。

卵を中型の元の皿に移します。培地を取り除き、うつ伏せのミリリットルあたり20ミリグラムの溶液で卵を覆います。皿を覆い、摂氏27度で60分間インキュベートします。

胚が酵素に十分に浸るように、皿を斜めに置いてください。必要な酵素を最小限に抑えるために、プラスチック製のトランスファーピペットを使用してプロナーゼを回収し、再利用し、氷の上に置きます。卵子を胚培地で5回洗って、孵化酵素を消化するのを防ぐために、傾向のあるすべての痕跡を取り除きます。

洗った卵を覆うのに十分な孵化酵素を追加します。コーリアンが溶けるときにつぶれないように、卵が皿の底の単層に残っていることを確認してください。卵を摂氏27度で孵化させます。

胚が酵素に十分に浸るように、皿を斜めに置いてください。解剖実体顕微鏡下での進行チェックに必要な酵素を最小限に抑えるために、コーリアンが完全に溶解する前に、コーリアンの内層に同様の穴が現れます。このプロセスは、酵素の活性にもよりますが、最大60分かかる場合があります。

コーリアンのごく一部が溶けたら、すぐにピペットで個々の卵を吸い上げて、孵化酵素による胚の消化を避けてください。ピペットの先端をBSSの1倍の清潔な皿にそっと触れ、卵をロールアウトさせて孵化酵素の移動を最小限に抑えて、BSSの1倍のきれいな皿に移します。鉗子を使用して、すべての卵が孵化酵素から移されたときに残りのコーリアンを取り除きます。

1倍BBSSの新しい料理に最終的な転送を行います。胚を胚発生の後期段階に持ち込む場合は、抗生物質を追加します この手順の装飾後、移植の1.5時間前にステージ12の胚のdecコーティングを開始します。ピペットチップを使用して、キャビティ顕微鏡の中心に少量の3%メチルセルロースを追加します。

9センチのシャーレに滑り込ませます。くぼみの表面に液体を薄く広げます。メチルセルロースを2分間乾燥させます。

スライドのくぼみを350マイクロリットルの滅菌BSS×BSSで満たし、解剖顕微鏡で観察します。広口のファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して、1人のドナーと最大4人のレシピエント胚をスライドに移します。ヘアループを使用して、ブラスターダームが上を向くように胚の向きを合わせます。

必要に応じて、安定性のために胚を互いに傾けます。マイクロニードルをドナーブラスターにそっと挿入します。皮膚。10〜20個の細胞をゆっくりと取り込みます。

次に、針をレシピエントの関連領域にそっと挿入します 胚ブラスター皮膚 ゆっくりとドナー細胞を排出します。チェロ嚢の境界を乱さないでください。ペトリ皿に約30ミリリットルの滅菌1回BSSを慎重に充填して胚を浸し、メチルセルロースから胚を緩めます。

胚を乱さないように皿の側面に注ぎます。100マイクロリットルのペニシリンストレプトマイシンを皿に加え、約0.3%の濃度で皿を覆います。必要に応じて定期的に胚を観察してください。

タイムラプスや詳細な観察などのより長いイメージング研究では、生きたコーティングされた胚をarosに埋め込む 生きた胚を入った培地にステージに適した麻酔薬を追加することで生きた胚を麻酔して動きを防ぎます 約1ミリリットルの3%の1回のBSSで低融点が発生し、摂氏37度に保ちます。必要に応じて、痙攣を防ぐためにアロスに適切な量の麻酔薬を追加し、固化を防ぐために迅速に働き、広口パスタピペットを使用してキャップを満たします。arosによるマイクロ遠心チューブの陥凹。

広口ピペットを使用して、コーティングされ麻酔された1つの胚をキャップ内のアロスに移動します。胚と一緒にできるだけ少ない培地を移します。すぐにアロと胚を更新し、3.5センチメートルのガラス底のペトリ皿に移します。

皿を14センチメートルの皿に移し、氷と水の混合物で3分の1を満たします。小さい方の皿を大きい方の皿の底にしっかりと押さえて、解剖実体顕微鏡で固定します。ヘアループを使用して、必要に応じて胚の向きをすばやく調整します。

アグロが固まるまで胚を静止させます。これで、胚を画像化できます。画像Aは移植直後のドナーとレシピエントの胚です。

ドナー胚は、完全に赤いラベルの石膏皮膚で右側に示されています。レシピエント胚は左側に示されており、ブラスターダーム画像Bに見える赤い移植細胞の小さな塊によって容易に識別され、移植後約7時間の2つのレシピエント胚を示しています。移植された細胞が移植部位から移動し、ブラスター全体に分散していることに注意してください。

皮膚画像Cは、ステージ29のレシピエントの胚を示しています。目の色素沈着と、体幹と脳の領域にmeforが存在することに注意してください。ロッドドミン標識細胞は、キメラの産生が成功したことを示すために、多くの胚構造にコロニーを形成していることがわかります。

メカフィッシュの胚を食べ、初期の胚段階で細胞移植を行う方法を紹介しました。この手順を行うときは、ドナー細胞をレシピエントの正しい領域に移植することを覚えておくことが重要です。これにより、ドナー細胞が正しい細胞タイプに分化することができます。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。