Name: 使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 P NMR分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学ぶLangendorff灌流と31P NMR分光法を用いたマウス心臓の機能・エネルギー代謝評価法。リアルタイムで高エネルギーリン酸化合物と心機能を同時測定し、心臓生理学および生化学研究に有用な手法です。

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著者らは、実験のNMR分光法の部分の間に彼女のサポートのためにリンスペンサーに感謝します。この作品は、保健基金R01 HL059246、R01 HL067970、R01 HL088634（博士天まで）とF32 HL096284（博士Kolwiczまで）の国立研究所からの補助金によって支えられている。

<ol><li>これらの実験では、2つの別々のシステムが同時に利用されている。 31 Pスペクトルの取得については、ブルカー14Tのマグネットは、AvanceのIIIのコンソールとトップスピンV2.1ソフトウェアを装備したコンピュータとのインターフェースです。心機能の評価のために、カスタム構築された心臓の灌流システムは、データ解析のためのLabChartPro 6ソフトウェアを搭載したPowerLab 4月30日データ収集、とのインターフェースです。 </li><li>実験当日、クレープス-ヘンゼライト1リットルのバッファーは、次のように調製する。0.5mmのEDTA、5.3mMのKCl、1.2mmのMgSO 4を 、118mMのNaCl、および25mMのNaHCO 3を 。次いで、混合物を5％CO 2 / 95％前に2mMのCaCl 2を加えて10〜15分間、O 2でバブリングする。最後に、基板は、10mMのグルコース及び0.5mmのピルビン酸の形で、追加されます。 </li><li>実験中の温度調節が重要です。 37.5 ° Cを中心に磁石内にあるとき - 温水循環装置は、37.0との間の温度を維持するために使用されています。温度は、光ファイバ温度プローブを用いた実験の期間が監視されています。 </li><li>灌流圧および左心室圧は、データ収集システムに接続されていると付属のソフトウェアを使用して表示される圧力トランスデューサを介して監視されます。これらは、実験に先立って、標準の血圧計で較正されています。さらに、圧力ラインはすべての気泡を除去するために、適切にフラッシュされます。 </li><li> 150mMのリン酸ナトリウム（KHのバッファーのイオン強度に相当する）の標準サンプルは、前に心臓の挿入にプローブを"校正"するために使用されます。これは、信号を容易にし、心臓がプローブ内に配置されると、取得期間を開始するのに必要な時間が短縮されます。 </li><li>凝固を減らすために、マウスが5分後にヘパリンIPの200単位を注入され、ペントバルビタールナトリウム（175 mg / kg）のIPが与えられます。 </li><li>心は急速に切り出した（そのまま肺および胸腺）と氷冷KHバッファに逮捕されている。 </li><li>氷上に置きながら、肺はすぐに削除されます。胸腺の葉が同定され、静かに大動脈を露出するために戻って剥離されています。胸腺は削除されます。大動脈は、慎重に周囲の組織を除去することによって分離されています。 </li><li>マイクロ縫合鉗子を穏やかに内腔を公開する大動脈の両方の壁を保持するために使用されます。大動脈を慎重に0.965ミリメートルODのポリエチレンチューブ（PE50）から作られたカニューレに配置されます。縫合糸がすぐに大動脈周囲に結び付けられている間に大動脈をミクロ血管クランプで固定されています。クリップが削除され、鉗子は慎重にカニューレを大動脈基部より上であることを確認するために使用されます。追加の関係はその場で心臓を保持するために必要に応じて追加されます。 </li><li>余分な組織は、鉗子とmicroscissorsを使用して削除されます。小切開は、左心耳に行われます。優しく心を保持している間に0.61ミリメートルODのポリエチレンチューブ（PE10）を慎重に頂点を介して左心房、左心室腔、および出力を介して挿入されます。過剰なチューブがトリミングされます。 </li><li>デフレート水で満たされた風船は、LVにアトリウムを介して挿入され、粘着テープや糸を使用して所定位置に保持される。蠕動ポンプの速度は徐々に心臓に十分な流量を提供するために増加しています。心臓は、NMRプローブに場所になるまで、心臓は約2ml /分に相当する一定の流量で灌流され続けます。 LVのバルーンは、LV圧変換器が機能していることを確認するためにマイクロシリンジを用いて、少量で膨らませている。 </li><li>心臓は慎重に10 mmのNMR管に挿入されます。ワイドボア"スピナー"は、プローブ内の適切な位置にチューブを誘導するために使用されます。装置全体は、しっかりと粘着テープで"臍帯"に添付されます。 </li><li>心臓/ NMR管は10mmのNMRプローブのコイルの内側になるまで、臍帯は、徐々に磁石の上部の穴に低下する。 </li><li>心臓は、プローブ内の適切な位置になると、蠕動ポンプの流量は、80mmHgの灌流圧を達成するために調整されます。 （この時点まで心臓が約2ml /分の一定流速で灌流されていることを、覚えておいてください）​​。灌流圧は、ポンプのコントローラ上の"ホールド"のメカニズムを有効にすることで維持されています。心臓は、その後15〜20分の平衡期間を許可されています。その間、LVのバルーンの体積は80〜10 mmHgの拡張末期圧を達成するために調整されます。 </li><li>平衡期間中に、それは可能な限り最高のリン信号を得るために、分光器のパラメーターを最適化する必要がある。これは、リン核が共振する周波数での電波のパルスを設定する（"チューニング"）と（"シム"）磁場を均一にすることによって達成されます。 </li><li>平衡期間の後、複数の31 P NMRスペクトルを得ることができます。各スペクトルの取得周期はtに依存しています彼はフィールドの磁石の強さ、標本の大きさ、および特定の実験に必要な信号対雑音比。スペクトルは、60度のフリップ角と2.0秒の遅延で20μsの256無線周波数パルスから得られる信号を平均で14 Telsaの磁石を使用して取得されます。この実験では約10分が必要になります。 </li></ol>代表的な結果データ集録ハードウェアとLabChartソフトウェアから、心機能のいくつかのパラメータは、実験プロトコルを通して測定することができます。心機能の代表的な指標は、左心室に開発圧力（LVDevP）は、収縮期血圧（図1）から拡張末期圧（EDP）を差し引くことにより得られる。この措置は、マウスの系統および心臓の状態（すなわち、圧力の過負荷）によって異なる場合があります。しかし、通常のC57BL6マウスの心臓でLVDevPは8-10 mmHgの固定拡張終期圧で100から110 mmHgの間に典型的です。さらに、LabChartのプログラムは、LVの圧力波の周期測定値に基づいて、心拍数の測定が可能になります。再び、この措置は変わることができますが、心は本質的な速度で打つために許可されているときに典型的な値は、350〜400 BPMです。しかし、心臓は、心拍数は420 BPMに保たれているペーシングシステムを使用して標準化することができる。さらに、収縮性（+ DP / DT）とリラクゼーション（-dP/dt）の措置がLVの圧力波の一次導関数を用いて推定することができます。実験プロトコール中には、圧力 - 体積の関係を組み込むことにより、スターリングのメカニズムを評価するのは簡単です。これは、LVのバルーンのボリュームが徐々に増加することとLVDevPだけでなく、EDPに注目することによって実現されます。これらの値は、図2に示すようにプロットすることができます。スターリング曲線が適しているが、80〜10 mmHgのEDPを達成するために必要なボリュームを指摘するLV室の寸法の間接的なアイデアを与えることができます。これは、拡張した心臓はコントロールに比べてより大きな音量を必要としながら肥大した心臓は通常、小さなバルーンのボリュームが必要になるからバンディング大動脈のモデルで使用することができます。表1は、灌流プロトコル中に取得された代表的な心機能のデータが表示されます。 31 P NMR分光計は、クレアチンリン酸の信号（PCR）とATP（γ- ATP、α- ATP、およびβ- ATP）と同様に、図2に示すように、無機リン酸塩（Pi）から三リン酸を提供します。これらのピークの各々の分析は、曲線下面積の値を提供します。 ATPの量は、γ- ATPとβ- ATPの領域を平均化することで推定される。 （NAD分子は全体の信号の未知の部分に寄与するので、α- ATPが使用されていない）。心の精力的な状況は、PCRおよびATPの分野の商（：ATP比PCR）によって決定されます。 1.7主な基質としてグルコースに付属のマウスの心臓で - この値は通常1.5です。 31 P NMRは、ATPまたはPCRの直接的な対策を提供していませんが、ピークの面積は、サンプル中の化合物を含有するリンの量に比例する。これらの信号の値は、他の方法を用いて推定することができます。例えば、心のコホートにおける高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるATPの直接的な対策は、平均的な濃度を得ることができる。この値は、スペクトルで観測された平均的なATPエリアを校正するために使用することができます。 PCRの濃度は、ATPの領域に相対的なPCR領域に基づいて計算することができます。それは、PCRの信号に無機リン酸塩（Pi）信号の相対的な化学シフトを分析することによってpHを推定することも可能です。1は、異なる無線パルスシーケンスを使用して、クレアチンキナーゼの反応速度やATP合成の反応速度も測定することができる2。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="表1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表1"> 表1。孤立した灌流心臓からベースラインの心機能。 LVDevP：左心室開発圧力、LVEDP：左室拡張末期圧、HR：心拍数、RPP：速度圧製品; + DP / DT：一次導関数LV圧正、-dP/dt：一次導関数LV圧負、PP ：灌流圧、CF：冠血流。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> LabChart Proソフトウェアから図1。代表LVの圧力波。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2制御（実線）と大動脈バンド（点線）マウスからの代表スターリング曲線。 A）などの増加LVのボリュームにLVDevPで表される収縮機能は、LVのバルーンの体積によって決まります。 B）拡張機能をのようなLVのバルーンの体積によって決定された左室容積を増やす以上のEDPで表される。 LVDevP：左心室開発した圧力（収縮期マイナス拡張期Pressure）、EDP：拡張末期圧。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 孤立した灌流マウス心臓の図3。代表31 P NMRスペクトル。比較的小さなパイのピークに注目してください。グルコースに加えて、ピルビン酸や脂肪酸に付属の好気的に灌流心臓においては、このピークは必要最小限にとどめます。虚血の期間中、このピークが増加するPCRのピークは減少する。 α- ATPピークの右側の肩に注目してください。これはNAD分子の寄与である。 π：無機リン酸塩、PCR：クレアチンリン酸、ATP：アデノシン三リン酸。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ランゲンドルフ灌流絶縁マウスの心臓の31 P NMR分光法は、信頼性と再現性のあるデータを提供します。3、4はしかし、それはLVのバルーンの大動脈と挿入のカニュレーションが安定した心機能を可能にするために適切にそのように行われていることが不可欠であるNMR内側間チューブ。さらに、温度​​調節は適切なベースラインの機能を達成するために重要です。良い、分析可能なNMRスペクトルを得る重要な要因の1つは、信号対雑音比を増加している。これは、最適な&quot;チューニング&quot;とサンプルの&quot;シミング&quot;を確保することによって達成することができます。プロトコルのテキストで述べたように、前に心臓の挿入に標準サンプルの使用は、これを容易にすることができます。適切なサイズの&quot;サンプル&quot;を持つことも役立ちます。取得時間の増加が良好なリンのスペクトルを得るために必要となるので、100未満mgを秤量ハーツは、通常より低いPCRおよびATPの信号を提供します。 心機能とエネルギー論に関する追加情報を集めるために、既存のプロトコルを変更するには、いくつかの方法があります。当研究室では、我々は脂肪酸のさまざまな組み合わせが存在する（低および高濃度で）、乳酸、ケトン、およびインスリンを含むことができる混合基質を緩衝液で灌流心を持っている。潅流液（すなわち、13 C標識基質）の安定同位体を使用することで、我々はTCAサイクルへの標識アセチルCoAの相対的な寄与によって基板の使用率を予測する能力を持っている。このアプリケーションでは5-7、我々は、アイソトポマーを実行する13 C3 -および13 C NMR分光法と13 C4 -グルタミン酸の分析。これは血流プロトコルの終わりに心を凍結クランプと凍結組織の抽出を行う必要があります。これは、分析は別のセットアップパラメータを持つ別のプローブを使用する必要があるとして、追加の実験になります。 31 P NMR分光法を用いて心臓の2 -デオキシグルコースリン酸塩の時間依存の蓄積を監視しながら、他のアプリケーションは、バッファ内のデオキシグルコースとグルコースの置換が含まれています。このメソッドは、心筋のグルコース取り込みを測定することができます。加えて7、8、私たちの研究室では、虚血/再灌流およびワークロードの高い課題から構成される灌流プロトコルにおける心機能およびエネルギー論を分析している6、8-10 要約すると、分離されたマウスの心の中で31 P NMR分光法は、高度な機器の使用を要求する技術的に困難な手順です。しかし、それが得られること、データは、遺伝子組み換えマウスモデルの機能とエネルギー論を分析することを望む研究者に貴重なものです。当研究室では、これらの技術は心臓機能、エネルギー論、および代謝上のストレッサーの様々な影響についての我々の理解に不可欠れている1、11、12

<table><tbody><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td><td>装置</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;PowerLab 4/30&lt;/a&gt;</td><td>装置</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;ML866/P&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;LabChart 6 Pro&lt;/a&gt;</td><td>装置</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank"&gt;MLS260/6&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;Quad Bridge Amp&lt;/a&gt;</td><td>装置</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank"&gt;ML224&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;STH Pump Controller&lt;/a&gt;</td><td>装置</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank"&gt;ML175&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;Minipuls 3 Peristaltic Pump&lt;/a&gt;</td><td>装置</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank"&gt;ML172&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;使い捨てBPトランスデューサ&lt;/a&gt;</td><td>装置</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank"&gt;MLT0699&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>10mm NMR試料管</td><td>装置</td><td>Wilmad LabGlass</td><td>513-7PP-7</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブPE10</td><td>装置</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;生理学的圧力トランスデューサ&lt;/a&gt;</td><td>装置</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank"&gt;MLT844&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブPE50</td><td>装置</td><td>BD Biosciences</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>マイクロメーターシリンジ</td><td>装置</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GS-1101</td><td></td></tr><tr><td>マクファーソンピンセット</td><td>装置</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-949</td><td></td></tr><tr><td>カストラビエホマイクロ鋏</td><td>装置</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Neoptixシグナルコンディショナー</td><td>装置</td><td>Neoptix, Inc.</td><td>Reflex - 1</td><td></td></tr></tbody></table>

使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 p nmr分光法

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

遺伝子組み換えマウスモデルでは、心血管疾患の分子変化とモデル間の因果関係を決定する際に強力な研究ツールとなっている。分子生物学は、シグナル伝達経路の主要な変更点を特定するのに必要ですが、それは機能的な意義の代用ではありません。生理学はそのままで代謝の生化学的評価と生理学を組み合わせた、機能の質問に対する答えを提供できる一方で、心臓を拍動する心臓の機能とエネルギー論の全体像を可能にする。長年にわたり、私たちの研究室では、このタスクを達成するために核磁気共鳴（NMR）分光法と組み合わせて単離心臓のperfusionsを活用している。心臓のエネルギー論を実行することによって測定される間、左心室機能は、ランゲンドルフモード単離心臓のperfusionsによって評価される<sup&gt; 31</sup&gt; P灌流心臓の磁気共鳴分光法。これらの技術により、ホスホクレアチンとATPのレベルとの組み合わせで心機能の指標は、心を打つで同時に測定することができます。生理学的または病理学的ストレッサーが提起されている間また、これらのパラメータをモニターすることができます。例えば、虚血/再灌流またはワークロードの高いチャレンジプロトコルを採用することができます。バンディング大動脈や心臓の病理学の他のモデルの使用は、同様にがちである。プロトコルに関係なく内の亜種の、トランスジェニックマウスモデルの分子修飾の機能的でエネルギッシュな意義は十分に関連する酵素や代謝経路に新たな知見につながる、説明することができます。そのため、<sup&gt; 31</sup孤立した灌流心臓の&gt; P NMR分光法は、心血管疾患の動物モデルでの貴重な研究手法です。

と一緒にランゲンドルフモード単離心臓の灌流、<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR分光法、一つの実験に生化学や生理学の分野を組み合わせたもの。同時に生理的な機能を監視しながら、プロトコルは、心臓の高エネルギーリン酸含有量と売上高の動的な測定が可能になります。正しく実行する場合、これは心臓のエネルギー論の評価に貴重な技術です。

使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 P NMR分光法

バイオエンジニアリングによるマウスモデルは、分子レベルの変化と……のモデルとの間の因果関係を明らかにするための強力な研究ツールとなっています。

本実験の全般的な目的は、単離灌流マウス心における心機能およびエネルギー代謝を観察することである。これは、マウス心にLORモードで灌流を行うことで達成される。第2ステップとして、グルコースとピルビン酸を添加したKrebs選択緩衝液を用いて、水で満たしたバルーンを左心室（lv）に挿入し、これにより実験中の心機能を継続的にモニタリングすることが可能となる。次に、心臓を10 millimeterのNMRチューブに入れ、マグネットに挿入します。これにより、TPのホスホクレアチンの共鳴を観察して心臓のエネルギー状態を評価します。また、LV圧力波、P 31、および質量分析pに基づいた心機能とエネルギー状態を示す無機リン酸の結果が得られました。こんにちは、ワシントン大学麻酔科、MIT Cadre代謝センターのSteve Kitzです。本日は、31 PNMR分光法を組み合わせた単離心灌流の手順について解説します。当研究室では、バイオエンジニアリングマウスモデルにおける心機能およびエネルギー代謝を評価するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、1 L の Krebs-Henseleit 液または KH バッファーを準備します。混合液に5%carbon dioxideと95%oxygenの気泡を10〜15分間導入します。次に、2 millimolarのcalcium chlorideを加え、続いて基質である10 millimolarのglucoseと0.5 millimolarのpyruvateを添加します。これらの実験では、P 31 Spectraの1回の取得につき、2つの独立したシステムを同時に使用します。心機能を評価するため、BRUER 14 Tマグネットをadvanced threeコンソールおよびtop spin V 2.1ソフトウェアを搭載したコンピュータに接続します。自作の心臓灌流システムをPowerLabに接続します。4つの30データリクイジションを使用します。データ解析にはlab chart PRO sixソフトウェアを搭載しています。心臓灌流装置には、KH緩衝液を心臓に灌流させるためのSTHポンプコントローラー制御のmini pulse threeペリスタルティックポンプが含まれます。NMR実験中の温度調節は極めて重要です。心臓がマグネット内にある間、加熱循環装置を用いて温度を37.0から37.5 °Cに維持し、実験期間中、光ファイバー温度プローブを用いて温度をモニタリングします。実験の間、LV圧および灌流圧は、データ収集システムに接続された圧力トランスデューサーを介してモニタリングされ、付属のソフトウェアを用いて表示されます。LV圧のモニタリングには生理学的トランスデューサーを使用し、灌流圧のモニタリングには使い捨て血圧トランスデューサーを使用します。最後に、加熱された酸素飽和緩衝液を心臓に供給するために、アンビリカルコード（臍帯）を使用します。マグネット内に入った後、実験を開始する前に、まず標準的なマノメーターを用いて圧力トランスデューサーの校正を行います。まず、トランスデューサーに圧力をかけない状態で校正をゼロに合わせます。次に、このマノメーターをより高い圧力まで加圧します。この値をコンピュータプログラムに入力してください。次に、この図のモーメントマノメーターを既知の圧力まで加圧し、コンピュータ画面上で確認することで、圧力トランスデューサが適切に校正されていることを確認します。圧力トランスデューサの校正が完了したら、150 millimolarのリン酸ナトリウム標準試料を入れた10 millimeter NMRチューブを用いて、NMRプローブを校正します。校正はTopSpinソフトウェアプログラムを使用して行ってください。まず、サンプルのチューニングを行い、リン共鳴の周波数を設定します。次に、サンプルのシミングを行い、均一な磁場を作成します。この初期校正により、信号が改善され、データ収集期間を開始するために必要な時間が短縮されます。マウスの心臓摘出を開始するために心臓をプローブ内に配置した後、凝固を抑制するため、ヘパリン 200 units を腹腔内に注射します。5分後、ペントバルビタールナトリウム 175 mg/kg を腹腔内に投与します。マウスが麻酔状態になったら、仰向けに寝かせ、胸部を露出させるために手足をテープで固定します。足指つまみテストを行い、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認します。切開します。ハサミで腹腔と胸腔を開き、ピンセットで肋骨を剥離して胸腔を露出させます。肺組織を保持し、曲がりハサミで心臓をそっと持ち上げます。心臓背面にある大血管を切断し、心臓が完全に遊離するまで、マウスの頭部方向へゆっくりと切断を進めます。直ちに氷冷したKH緩衝液で心臓を停止させます。臓器を氷上に保持し、速やかに肺を取り除きます。胸腺の葉を特定し、ゆっくりと剥がして大動脈を露出させます。次に、胸腺を除去します。最後に、周囲の組織を慎重に取り除き、大動脈を単離します。マイクロ縫合鉗子を用いて、通常は大動脈の両壁を保持して内腔を露出させます。次に、大動脈を慎重にカニューレ上に配置します。このカニューレは、外径0.965 millimeterのポリエチレンチューブで作られています。マイクロ血管クランプで大動脈を固定し、速やかに大動脈の周囲を縫合糸で結紮します。結紮後、クランプを取り除きます。ピンセットを使用し、カニュラが大動脈根部より上方に位置していることを慎重に確認してください。心臓を固定するために必要な結紮を適宜追加します。ピンセットとマイクロ鋏を用いて、不要な組織を除去します。次に、左心耳に小さな切開を加えます。心臓を優しく保持し、外径 0.61 millimeter のポリエチレンチューブを左心房、左心室腔を経て心尖部から外に出るように慎重に挿入します。余分なチューブを切り取ります。次に、脱気して水で満たしたバルーンを心房経由で左心室に挿入します。粘着テープを使用して、バルーンを固定します。次に、心臓に十分な流量が供給されるよう、ペリスタルティックポンプの速度を徐々に上げます。心臓をNMRプローブに設置するまで、約2 mL/minの一定流量でKH緩衝液による心臓灌流を継続します。マイクロメーターシリンジを用いて少量の液体でLVバルーンを膨らませ、NMR分光法用のLV圧力トランスデューサーが機能しているかを確認します。まず、心臓を10 millimeterのNMRチューブに注意深く挿入します。チューブを適切な位置に誘導しやすくするため、NMRチューブの周囲に幅広のボアスピナーを配置します。プローブ内部で、装置全体を粘着テープで臍帯にしっかりと固定します。次に、心臓が入ったNMRチューブが10 millimeter NMRプローブのコイル内に収まるまで、臍帯をマグネットの上部ボアへゆっくりと降ろします。心臓がプローブ内の適切な位置に配置されたら、灌流圧が80 millimeters of mercuryになるようにパラサイティックポンプの流量を調整します。ポンプコントローラーのホールド機能を有効にして、灌流圧を維持します。心臓を15〜20分間平衡化させます。平衡化期間中にLVバルーンの容量を調整し、拡張末期圧を8〜10 mmHgに設定します。次に、リンの信号を最大限に得られるよう、分光計のパラメータを最適化します。ラジオパルスを設定してNMR装置を調整し、リン原子核が共鳴する周波数を合わせます。その後、平衡期間を経て、磁場を均一にするためにサンプルのシミングを行います。複数回の31P NMRスペクトル測定を開始します。各スペクトルの測定時間は、磁石の磁場強度、試料量、および特定の実験に必要とされる信号対雑音比（S/N比）によって異なります。本手順では、14テスラの磁石を用い、フリップ角60度、パルス幅20マイクロ秒の無線周波数パルスを256回繰り返し、遅延時間を2.0秒に設定して信号を平均化することでスペクトルを取得します。この実験には約10分かかります。心機能の一般的な指標である左室（LV）発生圧は、収縮期血圧から心室拡張末期圧（EDP）を差し引くことで得られます。正常なC 57 black sixマウスにおいて、心室拡張末期圧を8から10 mmHgに固定した場合、左室発生圧は通常100から110 mmHgの間になります。コントロール群および大動脈絞扼マウスの代表的なスタイリング曲線を示す。収縮機能は、LVバルーンの体積によって決定されたLV容量の増加に伴うLV発生圧で表される。拡張機能は、LV容量の増加に伴うEDPで表される。単離灌流マウス心臓の $^{31}\text{P NMR}$ スペクトルでは、ホスホクレアチン（$\text{PCr}$）、$\text{ATP}$ 由来の3つのリン酸基、および無機リン酸（$\text{Pi}$）の信号が検出されます。ここでは $\text{Pi}$ ピークが相対的に小さくなっています。これは、ピルビン酸または脂肪酸を供給して好気的に灌流された心臓に典型的な結果です。虚血期間中のグルコースに加えて、このピークは増加し、一方でPCRピークは減少します。ここまでは、実験中に心機能とエナジェティクスの両方を同時に測定できるよう、マウス心臓を灌流するための準備方法について説明しました。心臓に十分な灌流が行われていることを確認することが重要です。さもなければ、NMRデータが信頼できなくなります。以上です。ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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