使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 ³¹ P NMR分光法

本実験の全般的な目的は、単離灌流マウス心における心機能およびエネルギー代謝を観察することである。これは、マウス心にLORモードで灌流を行うことで達成される。第2ステップとして、グルコースとピルビン酸を添加したKrebs選択緩衝液を用いて、水で満たしたバルーンを左心室（lv）に挿入し、これにより実験中の心機能を継続的にモニタリングすることが可能となる。

次に、心臓を10 millimeterのNMRチューブに入れ、マグネットに挿入します。これにより、TPのホスホクレアチンの共鳴を観察して心臓のエネルギー状態を評価します。また、LV圧力波、P 31、および質量分析pに基づいた心機能とエネルギー状態を示す無機リン酸の結果が得られました。こんにちは、ワシントン大学麻酔科、MIT Cadre代謝センターのSteve Kitzです。本日は、31 PNMR分光法を組み合わせた単離心灌流の手順について解説します。

当研究室では、バイオエンジニアリングマウスモデルにおける心機能およびエネルギー代謝を評価するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、1 L の Krebs-Henseleit 液または KH バッファーを準備します。

混合液に5%carbon dioxideと95%oxygenの気泡を10〜15分間導入します。次に、2 millimolarのcalcium chlorideを加え、続いて基質である10 millimolarのglucoseと0.5 millimolarのpyruvateを添加します。これらの実験では、P 31 Spectraの1回の取得につき、2つの独立したシステムを同時に使用します。

心機能を評価するため、BRUER 14 Tマグネットをadvanced threeコンソールおよびtop spin V 2.1ソフトウェアを搭載したコンピュータに接続します。自作の心臓灌流システムをPowerLabに接続します。4つの30データリクイジションを使用します。

データ解析にはlab chart PRO sixソフトウェアを搭載しています。心臓灌流装置には、KH緩衝液を心臓に灌流させるためのSTHポンプコントローラー制御のmini pulse threeペリスタルティックポンプが含まれます。NMR実験中の温度調節は極めて重要です。心臓がマグネット内にある間、加熱循環装置を用いて温度を37.0から37.5 °Cに維持し、実験期間中、光ファイバー温度プローブを用いて温度をモニタリングします。

実験の間、LV圧および灌流圧は、データ収集システムに接続された圧力トランスデューサーを介してモニタリングされ、付属のソフトウェアを用いて表示されます。LV圧のモニタリングには生理学的トランスデューサーを使用し、灌流圧のモニタリングには使い捨て血圧トランスデューサーを使用します。最後に、加熱された酸素飽和緩衝液を心臓に供給するために、アンビリカルコード（臍帯）を使用します。

マグネット内に入った後、実験を開始する前に、まず標準的なマノメーターを用いて圧力トランスデューサーの校正を行います。まず、トランスデューサーに圧力をかけない状態で校正をゼロに合わせます。次に、このマノメーターをより高い圧力まで加圧します。この値をコンピュータプログラムに入力してください。

次に、この図のモーメントマノメーターを既知の圧力まで加圧し、コンピュータ画面上で確認することで、圧力トランスデューサが適切に校正されていることを確認します。圧力トランスデューサの校正が完了したら、150 millimolarのリン酸ナトリウム標準試料を入れた10 millimeter NMRチューブを用いて、NMRプローブを校正します。校正はTopSpinソフトウェアプログラムを使用して行ってください。

まず、サンプルのチューニングを行い、リン共鳴の周波数を設定します。次に、サンプルのシミングを行い、均一な磁場を作成します。この初期校正により、信号が改善され、データ収集期間を開始するために必要な時間が短縮されます。

マウスの心臓摘出を開始するために心臓をプローブ内に配置した後、凝固を抑制するため、ヘパリン 200 units を腹腔内に注射します。5分後、ペントバルビタールナトリウム 175 mg/kg を腹腔内に投与します。マウスが麻酔状態になったら、仰向けに寝かせ、胸部を露出させるために手足をテープで固定します。

足指つまみテストを行い、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認します。切開します。ハサミで腹腔と胸腔を開き、ピンセットで肋骨を剥離して胸腔を露出させます。肺組織を保持し、曲がりハサミで心臓をそっと持ち上げます。

心臓背面にある大血管を切断し、心臓が完全に遊離するまで、マウスの頭部方向へゆっくりと切断を進めます。直ちに氷冷したKH緩衝液で心臓を停止させます。臓器を氷上に保持し、速やかに肺を取り除きます。

胸腺の葉を特定し、ゆっくりと剥がして大動脈を露出させます。次に、胸腺を除去します。最後に、周囲の組織を慎重に取り除き、大動脈を単離します。

マイクロ縫合鉗子を用いて、通常は大動脈の両壁を保持して内腔を露出させます。次に、大動脈を慎重にカニューレ上に配置します。このカニューレは、外径0.965 millimeterのポリエチレンチューブで作られています。

マイクロ血管クランプで大動脈を固定し、速やかに大動脈の周囲を縫合糸で結紮します。結紮後、クランプを取り除きます。ピンセットを使用し、カニュラが大動脈根部より上方に位置していることを慎重に確認してください。

心臓を固定するために必要な結紮を適宜追加します。ピンセットとマイクロ鋏を用いて、不要な組織を除去します。次に、左心耳に小さな切開を加えます。

心臓を優しく保持し、外径 0.61 millimeter のポリエチレンチューブを左心房、左心室腔を経て心尖部から外に出るように慎重に挿入します。余分なチューブを切り取ります。次に、脱気して水で満たしたバルーンを心房経由で左心室に挿入します。

粘着テープを使用して、バルーンを固定します。次に、心臓に十分な流量が供給されるよう、ペリスタルティックポンプの速度を徐々に上げます。心臓をNMRプローブに設置するまで、約2 mL/minの一定流量でKH緩衝液による心臓灌流を継続します。

マイクロメーターシリンジを用いて少量の液体でLVバルーンを膨らませ、NMR分光法用のLV圧力トランスデューサーが機能しているかを確認します。まず、心臓を10 millimeterのNMRチューブに注意深く挿入します。チューブを適切な位置に誘導しやすくするため、NMRチューブの周囲に幅広のボアスピナーを配置します。

プローブ内部で、装置全体を粘着テープで臍帯にしっかりと固定します。次に、心臓が入ったNMRチューブが10 millimeter NMRプローブのコイル内に収まるまで、臍帯をマグネットの上部ボアへゆっくりと降ろします。心臓がプローブ内の適切な位置に配置されたら、灌流圧が80 millimeters of mercuryになるようにパラサイティックポンプの流量を調整します。

ポンプコントローラーのホールド機能を有効にして、灌流圧を維持します。心臓を15〜20分間平衡化させます。平衡化期間中にLVバルーンの容量を調整し、拡張末期圧を8〜10 mmHgに設定します。

次に、リンの信号を最大限に得られるよう、分光計のパラメータを最適化します。ラジオパルスを設定してNMR装置を調整し、リン原子核が共鳴する周波数を合わせます。その後、平衡期間を経て、磁場を均一にするためにサンプルのシミングを行います。

複数回の31P NMRスペクトル測定を開始します。各スペクトルの測定時間は、磁石の磁場強度、試料量、および特定の実験に必要とされる信号対雑音比（S/N比）によって異なります。本手順では、14テスラの磁石を用い、フリップ角60度、パルス幅20マイクロ秒の無線周波数パルスを256回繰り返し、遅延時間を2.0秒に設定して信号を平均化することでスペクトルを取得します。

この実験には約10分かかります。心機能の一般的な指標である左室（LV）発生圧は、収縮期血圧から心室拡張末期圧（EDP）を差し引くことで得られます。正常なC 57 black sixマウスにおいて、心室拡張末期圧を8から10 mmHgに固定した場合、左室発生圧は通常100から110 mmHgの間になります。

コントロール群および大動脈絞扼マウスの代表的なスタイリング曲線を示す。収縮機能は、LVバルーンの体積によって決定されたLV容量の増加に伴うLV発生圧で表される。拡張機能は、LV容量の増加に伴うEDPで表される。

単離灌流マウス心臓の $^{31}\text{P NMR}$ スペクトルでは、ホスホクレアチン（$\text{PCr}$）、$\text{ATP}$ 由来の3つのリン酸基、および無機リン酸（$\text{Pi}$）の信号が検出されます。ここでは $\text{Pi}$ ピークが相対的に小さくなっています。これは、ピルビン酸または脂肪酸を供給して好気的に灌流された心臓に典型的な結果です。

虚血期間中のグルコースに加えて、このピークは増加し、一方でPCRピークは減少します。ここまでは、実験中に心機能とエナジェティクスの両方を同時に測定できるよう、マウス心臓を灌流するための準備方法について説明しました。心臓に十分な灌流が行われていることを確認することが重要です。

さもなければ、NMRデータが信頼できなくなります。以上です。ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。