Name: 薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-01T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶ 脳深部構造への精密マイクロインジェクション法。50μmガラスキャピラリーニードルを用いて薬物、ウイルスベクター、細胞移植を標的に送達し、脳損傷を最小限に抑える神経科学研究手法です。

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OG - PはCONACyTの助成金（CB - 2008から101476）とFRABA（10分の686）によってサポートされていました。 AQ - Hは、国立衛生研究所、ハワードヒューズ医学研究所、ロバートウッドジョンソン財団とメリーランド州の幹細胞財団によってサポートされています。

<ol><li>マウスの手術の前にガラスの針を作る： <ol class="lalpha"><li>マイクロピペットプラーでキャピラリーガラス管を置く。 </li><li>ローカライズされた領域でガラス管を柔らかくするためにガラス管の中央を加熱する。 </li><li>ローカライズされた領域内のガラス管の直径の減少を引き起こすのに十分な初期の距離によってその長手軸に沿ってガラス管を引き伸ばす。 </li><li>それが壊れるまで、ガラス管を伸ばしてください。この方法では、2つの同一のシングルバレルの針が得られる。 </li></ol></li><li>マイクロフォージのガラス針を刺します。 30 °の角度では、ベベルの先端をするのに十分です。 </li><li>各針が正しい内径を持っていることを顕微​​鏡下で確認してください。親水性薬物のほとんどは30〜50μmの内径は、（図1）に最適です。 </li><li>ガラス針の広い端から鉱物油を使用してニードルをいっぱいに。それは、キャピラリーチューブの長さの約50％に達するまで、その鉱物油（MSDS、猫。M7700）は、毛細管現象によって入るしましょう​​。針の広い端を密封するためにプランジャーの周り高真空グリースを（ダウコーニング、猫。05054 - AB）を入れます。 </li><li>針の広い年末までにプランジャーを挿入し、油の小滴をガラス針の先端から出て見えるまでやさしくミネラルオイルを押してください。 </li><li>インジェクターのホルダーにガラスの針を固定します。 </li><li> 2.5パーセントAVERTIN（2,2,2 - トリブロムエタノール+ tert -アミルアルコール、1:1 w / v）を持つマウスを麻酔。 Dosisグラム腹腔内あたり25 -30μlの。 </li><li> 37動物の体温を保つために定位装置℃までのヒーターパッドを入れて</li><li>耳のバーや歯のホルダーを使用して定位装置で、マウスの頭部を置き、固定します。 </li><li>二度目の70％エタノール、0.1％グルコン酸クロルヘキシジンに続く0.1％グルコン酸クロルヘキシジン溶液でマウスのヘッドのクリーニングを行ってください。 </li><li>ランバの頭蓋骨の線にマウスの耳から外科ブレード第15位で皮膚を切開する。 </li><li>それを乾燥し、手術野の皮膚を引き出すために綿のスワップで頭蓋骨を磨く。 </li><li>ブレグマの縫合糸の頂点を指すようにガラス針の先端を使用してください。そこでは、インジェクター（座標"ゼロ"）の初期位置を設定する必要があります。 </li><li>頭蓋骨上の定位装置の"X"と"Y"軸を移動して掘削するポイントを設定します。 </li><li>選択した座標系で非常に慎重に穴をあけます。 Microdrillsと他の金属のツールは、以前は250滅菌処理を行った·ドライガラス玉滅菌器で60秒C（コールパーマー、カタログ番号EW - 10779〜00）。 </li><li>微細な鉗子で慎重に骨の最も深い層を除去し、duramatter膜を（もし漏れある脳脊髄液を参照される）ブレーク。 </li><li>その針が開けた穴を通過できることを確認します。 </li><li>あなたがパラフィルムの小片にそれを注入して配置する薬剤のピペット1μL。 </li><li>頭蓋骨の上にパラフィルムを置く。 </li><li>もし流体がガラス針に上昇していることが顕微鏡下で確認しながら、インジェクターのホイールを回転することによって薬剤を吸い上げる。 </li><li>パラフィルムを外し、ゼロの座標を再設定します。 </li><li>ガラス針の先端が軽く、脳の表面に触れると、ゼロで"Z"の座標を設定するまでホルダー下に、選択された座標に針を移動します。 </li><li>選択された深さで脳実質内にガラスの針を導入する。 </li><li> 〜1 NL /秒の速度で徐々に薬剤を注入する。 </li><li>欲望のボリュームが注入されると、2分間実質への薬物拡散をしましょう​​。その後スムーズにゆっくりと針を取り除くに進んでください。 </li><li>接着剤は、手術創および定位装置から動物を削除し、麻酔の回復のために清潔なベッドを含む予め温めておいたケージに動物を置く。 </li><li>術後鎮痛を提供するために、すべての動物は24時間5 mg / kgを皮下ケトロラクごとに12時間を受け</li></ol>代表的な結果： このプロトコルに従うとき、非常に精密な注入が得られ、非常に狭い針のトラックは、脳損傷を最小限に抑えています。この方式の代表的な結果として、我々は白質の広大1-4の脱髄を生成する脳梁にlysophosphatidylコリン（リゾレシチン）を注入した。ガラス針で生成脳損傷を最小限に抑えるために、我々は、脳梁にリゾレシチンのわずか20 NLを注入したが、同じくらい200以上のボリュームを必要に応じて、NLは、同じ方法で注入することができる。脱髄は、白質の腸管（図2）におけるミエリン塩基性蛋白質の発現の不在によって検出される。 <img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。50μmの直径を有するガラス針。二つの短い目盛り間の距離規模で50μmの長さを表します。 <img src="/files/ftp_upload/2082/2082fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 脳梁に図2。リゾレシチン注入。脱髄は、ミエリン塩基性タンパク質の発現（点線部分）がないと表示されます。ガラスの針管（矢印）の小さなサイズに注意してください。バー= 100μmの

<ol><li>Menn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+oligodendrocytes+in+the+subventricular+zone+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain.</a> J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).</li>
<li>Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor+Induces+the+Progeny+of+Subventricular+Zone+Type+B+Cells+to+Migrate+and+Differentiate+into+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes.</a> Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).</li>
<li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+aspects+of+remyelination+after+demyelination+produced+by+the+intraneural+injection+of+lysophosphatidyl+choline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline.</a> J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).</li>
<li>Webster, G. R., Thompson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+presence+of+lysolecithin+in+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).</li>
<li>Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+Zone+Astrocytes+Are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain.</a> Cell. 97, 1-20 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36, 1021-1034 (2002).</li>
<li>Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).</li>
<li>Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+cell+transplantation+for+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy.</a> Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

方法は、脳に非常に正確な場所に薬物やウイルスベクターのほとんどを提供するために非常に便利ですこのビデオで示した。この技術の主な利点のいくつかは、ターゲットポイント、注射の正確さと脳の病変や消化管の損傷1、2、5、6の小さいサイズの信頼性です。かつて技術はmistargetingの範囲が50μm2、1以下をすべき標準化されています。細胞移植は、より広い、100から150μmの7-9、針を使用して行うことができます。したがって、効率的な細胞送達は、細胞の移植により誘導される巻き添え被害を最小限に抑え、非常に特定の病変に堆積することができます。このテクニックの3つの重要なステップがあります： <ol><li>我々は常にインシュリンの針と頭蓋骨は掘削前に選択した座標にラベルを付けるためにそっと傷をお勧めします。 </li><li>急速に脳の表面を貫通して迅速な動きとガラス針を導入する。 </li><li>最適な深さに達すると、あなたは薬が自由に脳内に拡散するためにできる&quot;運河&quot;を作るために、脳実質に深く針0.1mmを導入すべきである。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>毛細管ガラス管</td><td>Wiretrol I</td><td>5-000-1001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 730</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフォージ</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Model 48000</td><td></td></tr><tr><td>ミネラルオイル</td><td>MSDS</td><td>M7700</td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>Dow Corning</td><td>05054-AB</td><td></td></tr><tr><td>麻酔薬：2.5% Avertin</td><td></td><td></td><td>2,2,2-tribrom&amp;#8211;thanol + tert-amyl alcohol, 1:1 w/v</td></tr><tr><td>ヒーターパッド</td><td>Mastex</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model Kopf-900</td><td></td></tr><tr><td>外科用メス刃 # 15</td><td>Medi-Cut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロドリル</td><td>Ideal Micro Drill</td><td>67-1000</td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-&amp;mu;L マイクロピペット</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術用顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Vasiorkop with Contraves system</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>Narishige International</td><td>Model MO-10</td><td></td></tr></tbody></table>

薬の配達のためのmicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

脳実質へMicroinjectionsは薬物、ウイルスベクターまたは細胞移植を実現する重要な手続きです。注射針は、その軌道の間に生成される脳の病変だけでなく、脳が小さいだけでなく、時には複数の注射が必要な場合には特に、マウスの脳内の主要な関心事である。ここでは、大幅に脳の損傷を軽減し、齧歯類の脳に正確なターゲティングが可能な50μmの内腔を持つガラスキャピラリー針を製造する方法を示しています。このメソッドは、少量の配信が可能になります（20〜100 NLから）、出血のリスクを軽減し、脳実質への薬剤の受動拡散を最小限に抑えます。キャピラリーガラス管の異なるサイズを使用して、または針の内腔を変更することにより、物質や細胞のいくつかのタイプを注入することができます。ガラス毛細管とMicroinjectionsはインジェクション技術と小型げっ歯類での最小限の巻き添え被害をターゲティング脳深部に有意な改善を表しています。

この記事では、50μmのルーメンでガラスキャピラリー針を作成する方法を示しています。この手法は、大幅に、脳の損傷を軽減薬の受動拡散を最小限に抑え、齧歯類の脳に正確なターゲティングが可能になります。

薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

脳実質へのマイクロインジェクションは、薬剤、ウイルスベクター、または細胞移植を導入するための重要な手法です。...による脳病変は

この手順の最終的な目的は、薬物、ウイルスベクター、または細胞移植を目的として、脳深部構造に極めて精密なマイクロインジェクションを行うことです。まず、内径 50 µm のガラスキャピラリー針を作製します。次に、毛細管現象によって針の 50% をミネラルオイルで満たし、チューブの幅の広い端からプランジャーを挿入します。手順の3番目のステップは、注入したい物質または細胞懸濁液を針に充填することです。手順の最終ステップは、針先を挿入し、深部脳構造に物質を非常に低速で注入することです。最終的に、ガラスキャピラリー管を用いたマイクロインジェクションにより、脳内への物質の非常に精密なターゲティングを示す結果を得ることができます。こんにちは。メキシコのコリマ大学心理学部神経科学研究所のオスカー・ゴンザレスです。本日は、マウスの脳内に薬剤を投与するための、ガラスキャピラリーチューブを用いたマイクロインジェクションの手順について解説します。私たちは、成体神経幹細胞の研究において、この手順を日常的に用いています。それでは始めていきましょう。内径 50 µm のガラスキャピラリー針を用いて脳内へのマイクロインジェクションを行うことで、脳損傷を大幅に軽減し、薬剤の受動拡散を最小限に抑え、げっ歯類の脳内への精密な標的注入が可能になります。マイクロインジェクションを実施する前に、まずガラス針を作製する必要があります。まず、キャピラリーガラスチューブをマイクロピペットプラーの高抵抗電極に取り付けます。次に、マイクロピペットプラーの電極の電源を入れます。ガラスチューブの中央部を加熱して局所的に軟化させるため、ガラスチューブを長軸方向に3〜5 mmの初期距離で延伸させ、局所的な領域のガラスチューブ径を減少させます。ガラス管を、切れるまで伸ばし続けます。これらの手順を繰り返し、同一のシングルバレル針を2本作成します。次に、ガラス針をマイクロフォージにセットします。先端を面取りするには、30度の角度で十分です。最後に、針を顕微鏡下に置き、両方の内径が正しいかを確認します。ほとんどの親水性薬剤の場合、作製した針の内径は30から50 µmが理想的です。これらをマイクロインジェクションに使用する方法を確認しましょう。まず、作製した針の最も太い端からミネラルオイルを満たします。毛細管現象により、ミネラルオイルがキャピラリーチューブの長さの約50%に達するまで注入させます。ニードルの最も太い端に高真空グリースを塗り、プランジャーを挿入します。ガラスニードルの先端からミネラルオイルが少量滴下するまで、ゆっくりと押し出します。次に、マイクロインジェクターのホルダーにニードルを固定し、動物の注入準備を開始します。まず、動物の体温を維持するために、定在座標動物ホルダーにヒーティングパッドを設置します。37 °Cの状態で、麻酔をかけたマウスの頭部を剃毛し、定在座標装置に設置して固定します。イヤーバーと歯固定具を用いて固定した後、外科用メスで耳から頭蓋骨のLambda線まで皮膚を切開します。綿棒で頭蓋骨を拭いて乾燥させ、手術野から皮膚を排除します。次に、ガラス針の先端をbgma縫合の頂点に向け、そこに注入の初期位置を設定します。その後、脳定位固定装置のX軸およびY軸を頭蓋骨上で移動させ、穿孔する位置を設定します。研究用マイクロドリルを使用し、精密ピンセットを用いて選択した座標に慎重に穴を開けます。骨の最深層を慎重に除去し、硬膜を穿孔します。これにより、少量の脳脊髄液が漏出しているのが確認できます。穿孔した穴にニードルが通過できるか確認するため、ステレオタキシス装置のZ軸を用いてガラスニードルをゆっくりと下げます。次に、注入する薬剤を1 µLピペッティングし、小さなパラフィルム片の上に載せます。そのパラフィルムを頭蓋骨上に配置してください。マイクロインジェクターのホイールを回して薬剤を吸引しながら、顕微鏡で液体がガラス針の中に上昇していることを確認します。パラフィルムを取り除き、ゼロ座標をリセットします。次に、針を選択した座標まで移動させ、ガラス針の先端が脳表面に軽く触れるまでホルダーを下げ、Z座標をゼロに設定します。ガラス針を脳実質の所定の深さまで刺入します。薬剤を1秒あたり約1ナノリットルの速度でゆっくりと注入してください。所定の量を注入した後、薬剤が実質に拡散するまで2分間待ち、その後、針をゆっくりとスムーズに抜去します。最後に、手術創を接着剤で固定し、動物を定位固定装置から取り出します。動物を保温ケージに入れ、麻酔から回復させます。それでは、マイクロインジェクションの結果をいくつか示します。ガラス針による脳損傷を最小限に抑えるため、白質路の脱髄を誘導するリゾホスファチジルコリン（lyin）を脳梁に注入しました。注入したlyinの量はわずか20 litersでした。脱髄は、白質路におけるミエリン塩基性タンパク質の発現消失によって示されます。非常に精密な注入が行われており、針の穿刺路を極めて狭くすることで脳損傷を最小限に抑えています。以上で、脳深部構造への微量注入を行うためのガラス針の作製方法について説明しました。この手順を行う際は、手術室ですべての装置と材料をすぐに使用できる状態で準備しておくことが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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