薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

この手順の最終的な目的は、薬物、ウイルスベクター、または細胞移植を目的として、脳深部構造に極めて精密なマイクロインジェクションを行うことです。まず、内径 50 µm のガラスキャピラリー針を作製します。次に、毛細管現象によって針の 50% をミネラルオイルで満たし、チューブの幅の広い端からプランジャーを挿入します。

手順の3番目のステップは、注入したい物質または細胞懸濁液を針に充填することです。手順の最終ステップは、針先を挿入し、深部脳構造に物質を非常に低速で注入することです。最終的に、ガラスキャピラリー管を用いたマイクロインジェクションにより、脳内への物質の非常に精密なターゲティングを示す結果を得ることができます。

こんにちは。メキシコのコリマ大学心理学部神経科学研究所のオスカー・ゴンザレスです。本日は、マウスの脳内に薬剤を投与するための、ガラスキャピラリーチューブを用いたマイクロインジェクションの手順について解説します。私たちは、成体神経幹細胞の研究において、この手順を日常的に用いています。

それでは始めていきましょう。内径 50 µm のガラスキャピラリー針を用いて脳内へのマイクロインジェクションを行うことで、脳損傷を大幅に軽減し、薬剤の受動拡散を最小限に抑え、げっ歯類の脳内への精密な標的注入が可能になります。マイクロインジェクションを実施する前に、まずガラス針を作製する必要があります。

まず、キャピラリーガラスチューブをマイクロピペットプラーの高抵抗電極に取り付けます。次に、マイクロピペットプラーの電極の電源を入れます。ガラスチューブの中央部を加熱して局所的に軟化させるため、ガラスチューブを長軸方向に3〜5 mmの初期距離で延伸させ、局所的な領域のガラスチューブ径を減少させます。

ガラス管を、切れるまで伸ばし続けます。これらの手順を繰り返し、同一のシングルバレル針を2本作成します。次に、ガラス針をマイクロフォージにセットします。

先端を面取りするには、30度の角度で十分です。最後に、針を顕微鏡下に置き、両方の内径が正しいかを確認します。ほとんどの親水性薬剤の場合、作製した針の内径は30から50 µmが理想的です。

これらをマイクロインジェクションに使用する方法を確認しましょう。まず、作製した針の最も太い端からミネラルオイルを満たします。毛細管現象により、ミネラルオイルがキャピラリーチューブの長さの約50%に達するまで注入させます。

ニードルの最も太い端に高真空グリースを塗り、プランジャーを挿入します。ガラスニードルの先端からミネラルオイルが少量滴下するまで、ゆっくりと押し出します。次に、マイクロインジェクターのホルダーにニードルを固定し、動物の注入準備を開始します。

まず、動物の体温を維持するために、定在座標動物ホルダーにヒーティングパッドを設置します。37 °Cの状態で、麻酔をかけたマウスの頭部を剃毛し、定在座標装置に設置して固定します。イヤーバーと歯固定具を用いて固定した後、外科用メスで耳から頭蓋骨のLambda線まで皮膚を切開します。

綿棒で頭蓋骨を拭いて乾燥させ、手術野から皮膚を排除します。次に、ガラス針の先端をbgma縫合の頂点に向け、そこに注入の初期位置を設定します。その後、脳定位固定装置のX軸およびY軸を頭蓋骨上で移動させ、穿孔する位置を設定します。

研究用マイクロドリルを使用し、精密ピンセットを用いて選択した座標に慎重に穴を開けます。骨の最深層を慎重に除去し、硬膜を穿孔します。これにより、少量の脳脊髄液が漏出しているのが確認できます。

穿孔した穴にニードルが通過できるか確認するため、ステレオタキシス装置のZ軸を用いてガラスニードルをゆっくりと下げます。次に、注入する薬剤を1 µLピペッティングし、小さなパラフィルム片の上に載せます。そのパラフィルムを頭蓋骨上に配置してください。

マイクロインジェクターのホイールを回して薬剤を吸引しながら、顕微鏡で液体がガラス針の中に上昇していることを確認します。パラフィルムを取り除き、ゼロ座標をリセットします。次に、針を選択した座標まで移動させ、ガラス針の先端が脳表面に軽く触れるまでホルダーを下げ、Z座標をゼロに設定します。

ガラス針を脳実質の所定の深さまで刺入します。薬剤を1秒あたり約1ナノリットルの速度でゆっくりと注入してください。所定の量を注入した後、薬剤が実質に拡散するまで2分間待ち、その後、針をゆっくりとスムーズに抜去します。

最後に、手術創を接着剤で固定し、動物を定位固定装置から取り出します。動物を保温ケージに入れ、麻酔から回復させます。それでは、マイクロインジェクションの結果をいくつか示します。

ガラス針による脳損傷を最小限に抑えるため、白質路の脱髄を誘導するリゾホスファチジルコリン（lyin）を脳梁に注入しました。注入したlyinの量はわずか20 litersでした。脱髄は、白質路におけるミエリン塩基性タンパク質の発現消失によって示されます。非常に精密な注入が行われており、針の穿刺路を極めて狭くすることで脳損傷を最小限に抑えています。

以上で、脳深部構造への微量注入を行うためのガラス針の作製方法について説明しました。この手順を行う際は、手術室ですべての装置と材料をすぐに使用できる状態で準備しておくことが重要です。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。