薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング
2010年12月1日
この記事では、50μmのルーメンでガラスキャピラリー針を作成する方法を示しています。この手法は、大幅に、脳の損傷を軽減薬の受動拡散を最小限に抑え、齧歯類の脳に正確なターゲティングが可能になります。
この手順の全体的な目標は、薬物、ウイルスベクター、または細胞移植の送達のために、脳深部構造に高精度のマイクロインジェクションを行うことです。これは、最初に50マイクロメートルのルーメンを持つガラスキャピラリーニードルを製造することによって達成されます。手順の2番目のステップは、毛細管によって針の50%を鉱油で満たし、チューブの最も広い端にプランジャーを挿入することです。
手順の3番目のステップは、注入したい物質または細胞懸濁液を針にロードすることです。手順の最後のステップは、針先を導入し、非常に低い速度で物質を脳の深部構造に注入することです。最終的には、ガラス毛細管によるマイクロインジェクションを通じて、脳への物質の非常に正確な標的化を示す結果を得ることができます。
こんにちは、私はメキシコのコリマ大学心理学部神経科学研究所のオスカー・ゴンザレスです。本日は、ガラス製の毛細管を用いてマウスの脳内に薬剤を送達するためのマイクロインジェクションを行う手順をご紹介します。私たちは、成人の神経幹細胞を研究するのに十分な実験室でこの手順を使用しています。
それでは始めましょう。脳へのマイクロインジェクションに50マイクロメートルルーメンのガラス毛細管針を使用すると、脳の損傷が大幅に減少し、薬物の受動的拡散が最小限に抑えられ、げっ歯類の脳への正確なターゲティングが可能になります。マイクロインジェクションを行う前に、ガラス針を構築する必要があります。
まず、キャピラリーガラス管をマイクロピペットプーラーの引っ張り高抵抗電極に配置します。次に、マイクロピペットプーラーの電極をオンにします。ガラス管の中央部を加熱してガラス管を局所的に柔らかくするには、ガラス管をその長手方向軸に沿って初期距離3〜5ミリメートル引き伸ばし、局所領域のガラス管の直径を小さくするのに十分です。
ガラス管が壊れるまで伸ばし続けます。これらの手順を繰り返して、2つの同一のシングルバレル針を作成します。次に、ガラス針をマイクロフォージに入れます。
先端を斜角にするには、30度の角度で十分です。最後に、針を顕微鏡の下に置き、両方の内径が正しいことを確認します。ほとんどの親水性医薬品では、30〜50マイクロメートルの内径が針の構築に理想的です。
マイクロインジェクションにどのように使用するかを見てみましょう。まず、構築された針に最も広い端から鉱油を充填します。鉱油を毛細管の長さの約50%に達するまで毛細管から入り込ませます。
針の最も幅の広い端に高真空グリースを貼り、プランジャーを挿入します。ガラスの針の先端から出るシーンの小さな一滴まで、ミネラルオイルをやさしく押します。次に、針をマイクロインジェクターのホルダーに固定し、注射用の動物の準備を開始します。
まず、定位動物ホルダーに温熱パッドを装着して、動物の体温を保ちます。摂氏37度で、麻酔をかけたマウスの頭を剃り、定位装置に入れて固定します。イヤーバーと歯ホルダーを使用して、外科用ブレードを使用して、耳からラムダ頭蓋骨までの皮膚を切開します。
頭蓋骨を綿棒で磨いて乾かし、皮膚を手術野から引き出します。次に、ガラス針の先端を使用してbgma縫合糸の頂点を指し、そこに注射の初期位置を設定します。次に、定位装置のx軸とy軸を頭蓋骨上で移動することにより、ドリルする頭蓋骨上のポイントを設定します。
研究用マイクロドリルを使用して、選択した座標に細かい鉗子で慎重に穴を開けます。骨の最も深い層を慎重に取り除き、硬膜の近代的な膜を壊します。脳脊髄液が漏れ出しているのが見えます。
ドリルで開けた穴に針が通れることを確認するために、定位デバイスのZ軸を使ってガラス針をゆっくりと下げます。次に、注射する薬物の1マイクロリットルをピペットで取り、小さなパルファムの上に置きます。パルファムを頭蓋骨の上に置きます。
マイクロインジェクターホイールを回転させて薬物を吸い込み、液体がガラス針に上がっていることを顕微鏡で確認します。パラフィルムを取り外し、ゼロ座標をリセットします。次に、針を選択した座標に移動し、ガラス針の先端が脳の表面にそっと触れるまでホルダーを下げ、Z.Coordinateをゼロに設定します。
ガラス針を脳実質に所望の深さで導入します。薬物を毎秒約1ナノリットルの速度でゆっくりと注射します。所望の量を注射したら、薬物を実質に2分間拡散させ、その後、針を滑らかかつゆっくりと取り外すことに進みます。
最後に、外科的創傷を接着し、定位装置から動物を取り除きます。麻酔回復のために動物を戦前のケージに入れます。次に、マイクロインジェクションの結果をいくつか示します。
リゾホスファチジルコリンまたはリンは、ガラス針によって生じる脳損傷を最小限に抑えるために、白質路の脱髄を引き起こす体細胞に注射されました。20リットルのlyinだけが注入されました。脱髄は、白質管にミエリン塩基性タンパク質の発現がないことによって表され、非常に正確な注射が得られ、非常に狭い針路が脳損傷を最小限に抑えます。
ここまで、脳深部構造にマイクロインジェクションを行うためのガラス針の作り方をお見せしました。この手順を行うときは、手術室で使用するためのすべての機器と材料を準備しておくことを忘れないでください。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、脳の深部構造への正確なマイクロ注射を可能にする、50-μmの内径を持つガラス毛細管針を作成する方法を紹介します。この技術は脳へのダメージを最小限に抑え、薬物の受動的拡散を減少させ、げっ歯類モデルでの標的投与を可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- マイクロ注射技術
- 薬物送達システム
背景
- マイクロ注射は、物質を脳に直接送達するために不可欠です。
- 従来の方法では、重大な脳損傷や非効率的な薬物送達を引き起こす可能性があります。
- ガラス毛細管針は、正確な標的投与のための解決策を提供します。
- この研究は、マイクロ注射プロセスの改善に焦点を当てています。
研究の目的
- 50-μmの内径を持つガラス毛細管針を作成する方法を開発する。
- 脳の深部構造への薬物送達の精度を向上させる。
- 注射プロセス中の脳損傷を最小限に抑える。
使用された方法
- 50 μmの内径を持つガラス毛細管針の製造。
- 注射を容易にするために針をミネラルオイルで満たす。
- 希望する物質または細胞懸濁液を針にロードする。
- 標的脳領域に低流速で物質を注射する。
主な結果
- この方法により、脳内の物質の正確な標的投与が可能になります。
- 従来の方法と比較して、脳損傷を大幅に減少させます。
- 薬物、ウイルスベクター、または細胞移植の効率的な送達。
- げっ歯類モデルでの有効性が実証されています。
結論
- 開発された技術は、マイクロ注射の精度を向上させます。
- 神経科学研究における薬物送達の信頼できる方法を提供します。
- このアプローチは様々な物質に適用でき、実験結果を改善します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise delivery of therapeutic agents to deep brain structures remains a critical challenge in neuroscience drug development, particularly in small animal models where procedural trauma can confound results. This microinjection method enhances target engagement fidelity by minimizing injection-induced tissue damage and passive diffusion, thereby improving the reliability of pharmacological and genetic intervention studies. The approach supports mechanistic de-risking in early discovery by enabling reproducible, low-volume delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants with reduced biological variability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables accurate interrogation of therapeutic hypotheses in deep brain nuclei by reducing off-target effects from injection trauma.
- Operational Value: Supports consistent delivery of compounds or genetic tools across studies, improving reproducibility in target validation workflows.
- Predictive Confidence: Minimizes procedural variability that could obscure true pharmacological or biological responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with minimal lesion burden for downstream compound screening in CNS pathways.
- Operational Value: Enables standardized, low-volume (20–100 nl) injections suitable for high-precision assay formats requiring tight pharmacokinetic control.
- Platform Reuse: Adaptable to various substances (drugs, viral vectors, cells) by adjusting needle lumen size, supporting multi-modal screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease model fidelity by reducing confounding injury from injection procedures, improving translational relevance.
- Operational Value: Facilitates repeatable interventions in longitudinal studies, supporting chronic dosing or cell transplant regimens.
- Risk-Adjusted Advancement: Improves confidence in target engagement data, aiding go/no-go decisions in preclinical programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where precise CNS delivery is essential for assessing target modulation and pathway engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in deep brain structures by enabling accurate delivery of pharmacological or genetic probes.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible dosing for compound evaluation in vivo, critical for dose-response and target occupancy studies.
- Analytics: Generates clean readouts by minimizing procedure-induced noise, improving signal detection in biomarker or efficacy measurements.
- Translational Research: Promotes continuity from discovery to preclinical by ensuring consistent, low-trauma delivery across study phases.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable capability for CNS delivery applicable across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from injection artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and studies through defined needle preparation and injection parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed studies due to procedural variability or off-target effects.
- Portfolio Impact: Enables more reliable prioritization of CNS targets based on cleaner pharmacological and genetic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, stereotactic coordination, and needle fabrication using a pipette puller and micro forge.
- Depends on access to specialized instrumentation including a stereotactic frame, microinjector, and microscope for needle visualization.
- Necessitates standardization of needle lumen size (50 µm) and filling protocol (50% mineral oil) for consistent performance across users.
- Adaptation to different model systems may require coordinate adjustment and validation of needle penetration depth.
- Practical limitations include the technical skill needed for needle pulling and beveling, and the low throughput inherent to manual microinjection.
