Name: RhoC GTPアーゼ活性化アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶRhoC GTPアーゼ活性化アッセイで細胞内の活性型RhoCを定量化する方法。プルダウンアッセイを用いてGTP結合型RhoCレベルを測定し、細胞シグナル伝達メカニズムの理解に貢献します。

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1。 GST -融合タンパク質を準備<ol><li> BamH1/EcoR1 pGEX3xベクターにサブクローニングrhotekinのRho結合ドメイン（RBD）の最初のN末端90アミノ酸を含むJM109コンピテント細菌のグリセロールストックが行われます。 高効率を確保するために、次の手順は、各実験のために実行しなければなりません。我々の経験では、新しく調製したGST - RBDは、堅牢で正確な分子量GTPase活性化アッセイの鍵となります。 </li><li> LBアンプ50mlにグリセロールストックのμL50（おおよそ、解凍しないで）追加し、振盪しながら37℃で一晩を成長させる。 </li><li> 500mLのLBアンプで1:10に希釈し、1時間拡大</li><li> 2時間のためにIPTGを0.1mMのでGST -タンパク質の産生を誘導する。 </li><li> 5000に遠心ボトルや遠心分離機、Sorval GSA3ローターに均等に配布するRPM 4℃で20分間。 </li><li>遠心ボトルにペレットを再懸濁します、溶解緩衝液10ml * *細菌溶解バッファー：20％ショ糖、10％グリセロール、50mMのトリスpH8.0、0.2mMののNa 2 S 2 O 5、2mMのMgCl 2、2mMのDTTは、新鮮なPMSF、ベンズアミド、アプロチニンおよびロイペプチンを追加。 </li><li> 2〜3分間（これは超音波処理器の種類によって異なります。私たちは、マーク6で設定されたフィッシャーソニックDismembranatorモデル500、50％のサイクルを使用する）超音波洗浄します。 </li><li>遠心分離機、ソーバルSS34、4℃で20分10,000回転℃、この時点で小アリコートを取り出すことができるとSDS - PAGEによって実行されます。ゲルはクマシーで染​​色することができますし、バンドは46 kDaの明らかなはずである。 </li><li>上清を除去し、50％glutatione -セファロース4Bスラリーの1 mLを加える。 </li><li> 4℃で30分間インキュベート° Cを回転した。溶解緩衝液で3回洗浄する。 </li><li> GST -魚のバッファを使用して50％スラリー（約1ml）にGST-RBD/glutatione-Sepharoseビーズを再懸濁します** ** GST -魚のバッファ：10％グリセロール、50mMのトリスpH7.4の、100mMのNaCl、1％NP - 4、2mMのMgCl 2、新鮮なPMSF、ベンズアミド、アプロチニンおよびロイペプチンを追加する</li></ol> 2。 GST -融合は、アッセイをプルダウン<ol><li> 5〜10 × 10 6細胞/アッセイを使用して、 </li><li>一度、氷冷PBSで細胞を洗浄、氷上にプレートを保つ（我々が氷で満たされた平らなガラス皿を使用）と0.5mLのGST -魚のバッファーで溶解する。 </li><li>氷上で5分間インキュベートする、ラバーポリスマンやフラットスクラッパーを使用して、収穫の細胞は、チューブを遠心し、4℃で20,000 rpmの5分を遠心分離して譲渡℃に</li><li>新鮮なマイクロ遠心チューブに上清を移す。合計ローを（すなわちGDP + GTP結合）を決定するために50μLを取る。 </li><li> 0.5mLのGST-RBD/glutatione-Sepharoseビーズを追加し、4℃で回転で一晩℃で、インキュベートする。 </li><li> GST -魚のバッファ付き6X洗います。 </li><li> 40μL2X - Laemelliサンプルバッファーで再懸濁し、ビーズ この時点で2.4にかかった合計Rhoタンパク質のアリコートの濃度を測定し、30μgのは、対応するアクティベーションサンプルでゲル上で実行されるようにしておく必要があります。 </li><li>沸騰サンプルは90℃で5分間、軽く遠心し、上清（すなわち、ビーズを避けるために）負荷がかかると12ウェル4-20％グラジエントSDS - PAGEゲル上で実行されます。 </li><li>ないより高い150よりボルト、Towbinバッファーを用いてメンブレンにトランスファーし、100 Wの定電流で泳動する</li><li> RhoC - specfic抗体と5％ミルク/ TBST液とプローブをメンブレンにブロックする。 </li></ol> 3。代表的な結果良い結果は約22 kDaの単一バンドを生成する必要があります。悪い結果では、複数のバンドや高いバックグラウンドを生成する。これは、タンパク質分解、サンプルの不完全な洗浄または古いGST - RBDの使用を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。RhoC GTP加水分解酵素の異なるレベルを表現する3つの別々の細胞株は、アクティブおよび総RhoCなしRhoCのアクティブと合計RhoC、高レベルの低レベルを実証するために示されている。ブロットは、取り除かれ、合計RhoCタンパク質のためのローディングコントロールとしてハウスキーピング遺伝子のアクチンに対する抗体で再プローブした。 <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。タンパク質分解、サンプルの不完全な洗浄または古いGST - RBDの使用から複数のバンドや高いバックグラウンドの結果は。

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

手順の最も重要なステップは、新鮮なGST - RBDの世代です。このステップに細心の注意を払うために失敗は失敗の主な理由です。すべてのステップは、細胞溶解液（2.5）で一晩インキュベーションにGST - RBD（1.2）の世代から、一日で行う必要があります。もう一つの重要なステップは、細胞ライセートを生成するために十分な細胞があることを一定にすることです。セル内の低いレベルで存在する傾向があるRhoC GTPアーゼ、を見るとこれが特に重要である。

<table><tbody><tr><td>グルタチオンセファロース 4B ビーズ</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Criterion 4-20% Tris-HCl ゲル</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpアーゼ活性化アッセイ

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPアーゼは、RhoAのGTPアーゼ〜91％の相同性を持っています。ために細胞内での有病率から、RhoAのGTPアーゼのための多くの試薬および技術が開発されている。しかし、RhoC GTPアーゼは、比較的低レベルでの転移性癌細胞に発現している。したがって、少数のRhoC固有の試薬が開発されている。私たちはRhoC低分子量GTPaseを検出するためのRho活性化アッセイを適応している。この手法は、アクティブなRhoC GTPアーゼを引き出すためにGST - Rhoの結合ドメイン融合タンパク質を利用しています。さらに、我々は全体のレベル（GTPおよびGDP結合）RhoCのGTPアーゼを決定するアッセイの開始時に総タンパク質を収穫することができます。これは、セル内のアクティブな対総RhoC GTP加水分解酵素の測定が可能になります。この手順のいくつかの商用バージョンがしかし、市販のキットはRhoAのGTP加水分解のために最適化されており、通常はRhoC GTPアーゼのためにうまく動作しない開発されています。アッセイの部分はRhoC特異的抗体の開発だけでなく、変更されています。

このプロトコルは、細胞内のアクティブなRhoC低分子量GTPaseのレベルを決定するためにプルダウンアッセイを利用しています。

RhoC GTPアーゼ活性化アッセイ

RhoC GTPaseはRhoA GTPaseと91%の相同性を有している。細胞内での普及率が高いため、RhoA GTPase向けの多くの試薬や手法が開発されてきた。...

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここで紹介する方法が有効にGEFをするための高い親和性を有する変異体RhoAのGST融合タンパク質を利用することにより、培養細胞におけるRhoAの特定のGDP / GTP交換因子（GEF）の活性化に従うアッセイを説明しています。...

上皮細胞ライセートからのGSTタグ付き突然変異体のRhoタンパク質（GST-RhoAは（G17A））を使用してアクティブロー-GEFの親和性降水

このビデオでは、GTPase結合タンパク質パートナーを研究するための競合アッセイを実演しています。磁気ビーズに固定化されたヌクレオチド結合GTPaseタンパク質を利用すると、GTPase上の同じ結合部位に対する2つの相互作用タンパク質パートナー間の競合的結合を研究し、タンパク質パートナーの結合親和性を評価することができます。...

競合するGTPase結合タンパク質パートナーを研究するための競合結合アッセイ

ここで説明する蛍光に基づくカルシウム動員アッセイは、オーファンGタンパク質共役受容体（GPCR）の機能的に活性化するリガンド（単数または複数）の同定のための培地スループット逆薬理スクリーニングシステムである。...

蛍光ベースのカルシウム動員アッセイによるGタンパク質共役受容体のキャラクタリゼーション

このプロトコルは、Rac1を含むRhoファミリーGTPaseの結合パートナーの相対的な親和性を比較します。In...

競合アッセイを使用してGTPアーゼ結合タンパク質の親和性を比較すると、

グアノシン三リン酸（GTP）結合は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性化における最も初期の事象の1つである。このプロトコルは、放射性標識GTP類似体[ 35 S]グアノシン-5'-O-（3-チオ）トリホスフェート（[ 35 S]GTPγS）の結合をモニターすることにより、特定のGPCR-リガンド相互作用を薬理学的に特徴付ける方法を説明する。目的のリガンドに対する応答。...

ラジオ標識GTP結合を介したGタンパク質共役型受容体シグナルの測定

ここでプレニル化とグアノシン 5'-三リン酸 (GTP) を調査するためのプロトコルを説明-GTPase の読み込み。このプロトコルは、2 つの詳細なメソッドで構成されています、すなわち膜分画と gtp アーゼ抗体アッセイします。プレニル化と GTP を測定するプロトコルを使用することができます別の他の低分子量 g...

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

このレポートでは、視覚GPCR、ロドプシン、およびmini-G...

結晶化を成功させるための視覚的GPCR-mini-Gタンパク質シグナル伝達複合体の戦略的スクリーニングと特性評価

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、...

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

私たちは、生細胞の小胞体-ミトコンドリア接触をモニターするためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを確立しました。このアッセイを用いて、化学処理の条件下で、HEK293T細胞内のこれらのオルガネラ間カップリングのレベルを定量的に測定するプロトコールを記載します。...

生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ

この研究は、繊毛形成の細胞モデルにおけるSHHアゴニストを用いた一次繊毛媒介性ソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達経路活性化のための定量的PCRベースのアッセイを実証しています。...

繊毛形成の細胞モデルにおけるソニックヘッジホッグシグナル伝達を測定するための定量的PCRベースアッセイ

学ぶRhoC GTPアーゼ活性化アッセイで細胞内の活性型RhoCを定量化する方法。プルダウンアッセイを用いてGTP結合型RhoCレベルを測定し、細胞シグナル伝達メカニズムの理解に貢献します。

RhoC GTPアーゼ活性化アッセイ

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