ポリカプロラクトン、エラスチン、コラーゲンを使用してネイティブ動脈アーキテクチャを模倣するためにトライレイヤーエレクトロスピニング：予備的研究

本実験の全般的な目的は、異なる層の材料特性の変化が、グラフト全体の機械的特性にどのように影響するかを観察することです。これは、天然および合成ポリマー溶液を調製し、最適なエレクトロスピンニング条件を決定することで達成されます。第2段階として、溶液を特定の比率で混合し、目的とする材料特性の変化を実現させます。

次に、溶液を円筒状のマンドレル上に電界紡糸し、機械的特性が異なる多層構造を作製します。コンプライアンス、破断強度、縫合保持力、単軸引張試験、および数学的解析に基づいた機械的特性の変化を示す結果が得られます。こんにちは、マイケル・マクルーアです。

本日は、グラフトの3層構造エレクトロスパン電場紡糸法についてお話しします。単一の血管グラフトなどの他の手法と比較した際の本手法の主な利点の一つは、個々の層における材料特性を微調整でき、それによって材料全体の機械的特性を制御できる点にあります。エレクトロスパンを行う前に、酢酸ベースのプロセスを用いて、6ヶ月齢の牛真皮からコラーゲンを抽出します。抽出されたコラーゲンは、その後、一連の溶解、沈殿、および透析を経て精製されます。エレクトロスパンの手順のために、凍結乾燥コラーゲンを少なくとも 500 milligrams 回収してください。

次に、20 mLのシンチレーションバイアルを用いて、150 mgのモノマーペレットを量り取り、50 mLの1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールに溶解させて、100 mg/mLのポリカプロラクトン溶液を調製します。同様の手順で、200 mg/mLのエラスチン溶液7 mLと、7 mg/mLのコラーゲン溶液を調製します。その後、5本のシンチレーションバイアルを使用し、各バイアルに計5 mLのPCL、エラスチン、コラーゲン溶液を以下の体積比で混合します。動脈内膜を模したPCL:エラスチン:コラーゲン＝98:2:0、動脈中膜を模した45:45:10、55:35:10および65:25:10、そして動脈外膜を模した70:0:30です。

次に、3 mLの18ゲージ鈍端針を使用し、3 mLの溶液をシリンジポンプに充填します。各PCL-エラスチン-コラーゲン溶液の個別の材料特性に従い、吐出速度を4 mL/hに設定し、計3 mLを吐出させます。

これらの溶液を矩形のマンドリル上に電界紡糸し、PCL、エラスチン、コラーゲンのポリマー溶液を用いて多層構造のグラフトを作製します。電界紡糸速度は、移行層および各層の紡糸に応じて変化させます。内膜用のポリマー溶液は、流速 4 mL/h で 0.5 mL 分を紡糸します。続いて、内膜用と中膜用の両方のシリンジを組み合わせた移行層を、それぞれ 0.2 mL、流速 2 mL/h で紡糸します。次に、内膜用シリンジを停止し、中膜層を 4 mL/h の流速で 0.6 mL 分紡糸します。

続いて、培地用シリンジとadventis用シリンジの間で、ポリマー溶液0.2 millilitersをそれぞれ2 milliliters/hourの速度で移行させます。最後に、培地用シリンジを停止し、adventisを4 milliliters/hourの速度で0.4 milliliters分、電界紡糸し続けます。電界紡糸後、各サンプルに50 millimolar EDCを使用し、さらなる試験を行う前に18時間かけて架橋させます。

電方も紡糸材料の一軸引張パラメータを試験するには、まず電方も紡糸シートを1×PBS 15 mLに入れ、ペトリ皿内で24時間水和させます。次に、標点距離7.5 mm、最も狭い部分の幅が2.5 mmのドッグボーンパンチを用いて、電方も紡糸マットから6つのサンプルを打ち抜きます。この形状にすることで、材料の破断が最も狭い部分で起こることが保証されます。

次に、MTS Bionics 200試験システムを用い、100 Nのロードセルおよび分速10 mmの伸長速度で、電極BUNサンプルを試験します。試験用ソフトウェアを使用して、各材料製品の最大応力、弾性係数、および破断ひずみを算出します。多層グラフトの縫合保持力を試験するために、直径2 mm、長さ3 mmの電極スポンジ管状検体を6つ採取し、37 °Cのインキュベーター内で1×PBSを入れたペトリ皿に24時間浸漬させます。

次に、50 Nのロードセルを使用し、伸長速度を150 millimeters per minuteに設定します。MTX bionic 200システムを用いて縫合保持強度を試験するには、市販の5-0 PDS II バイオレット モノフィラメント糸を配置します。

キャリパーを用いてサンプルの端から2 mmの位置を測定し、縫合します。その後、グラフトが縫合糸から抜け出すまで伸展させ、TestWorks Version 4を用いて最大荷重をgfで記録します。電解紡糸グラフトの破裂強度を試験するために、直径2 mm、長さ2〜3 cmの電解紡糸管状検体をさらに6個採取し、37 °CのPBS中で24時間水和させます。水和後、デバイスに取り付けられた直径1.5 mmのニップルにチューブを装着し、グラフトとニップルの端をサージョンノットで結んで2-0シルクサutureで固定します。次に、破裂試験システムに空気を導入し、チューブが破裂するまで5 mmHg/sの速度で圧力を上昇させます。

チューブが破裂した時の水銀柱ミリメートル（mmHg）としての圧力で、破裂強度のデータを収集します。最後に、6つの異なる電界紡糸グラフトから、直径2 mm、長さ3 cmに切断した管状グラフトを6本採取し、動的コンプライアンスを評価します。サンプルをPBS中で24時間水和させます。

37 °Cにて。カスタムメイドの直径 1.5 mm のニップルにグラフトを装着し、2-0 シルク縫合糸を用いてサージョンノットで固定する。これらのグラフトを、Tissue Growth Technologies社によって開発された、機械的刺激によるインテリジェント組織工学バイオリアクターに設置する。

バイオリアクターに37 °CのPBSを500 milliliters充填します。バイオリアクターを設定し、グラフト内部に1 hertzの周期的な圧力変化を与え、収縮期・拡張期血圧として90/50、120/80、150/110 millimeters of mercuryの3つの異なる圧力レベルでテストします。エレクトロスピンニングのプロトコルが正しく実施されていれば、最終製品は、ここに示すように、層間の剥離の初期兆候が見られない、継ぎ目のないソフトなチューブになります。

比較のために、層間剥離したチューブをここに示します。この画像は、特定のPCL・エラスチン・コラーゲン混合物を含む内膜、中膜、外膜の各層における、接線方向のピーク応力および破断ひずみの単軸引張試験値に関する情報を提供しています。傾向として、PCL含有量の増加に伴いピーク応力と接線弾性係数は増加し、一方で破断ひずみは減少することが示されています。縫合保持強度の結果がここに示されており、E-P-T-F-Eが最高の縫合保持強度を示し、65:25:10が破線で示された外在静脈の標準値に最も近い結果となりました。比較として、非生存豚の大腿動脈およびE-P-T-F-Eが試験されました。

このグラフに示されている破裂圧力から、55:35:10および65:25:10の材料が最も高い破裂圧力を持つことがわかります。これは、米国国家規格協会（ANSI）が市販目的のすべての血管グラフトに要求している1,600 mmHgという基準に近い値です。最後に、3つの異なる平均動脈圧における内部半径から算出したコンプライアンス試験により、中膜層のみのPCL含有量を増加させると、3種類すべての生理学的圧力においてコンプライアンスが段階的に低下することが示されました。本研究において最も重要な部分は、法制化のプロセスです。

3対1の入力・出力を使用すると、ノズルのアーキン電荷損失が発生することがあります。これが起こると、現在電界紡糸されているポリマーに伴うバルジが減少する場合もあります。これにより、繊維が濡れた状態で融着したり、3つの層の間で剥離が生じたりすることがあります。

したがって、三層構造の血管グラフトを電界紡糸する際には、一定の電位を維持することが不可欠です。