Name: 腱の生体外で機械的負荷 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶ腱の生体外機械的負荷法。アクチュエーターを用いて4本の腱を同時にサイクリック負荷し、手首や肘の腱障害のメカニズム解明と治療法開発に貢献する研究手法を習得できます。

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<ol><li>ウシ胎児血清、L -グルタミン、抗生物質、およびアスコルビン酸とメディアCO 2 -独立系メディアを補完する</li><li> 50 mlの遠心チューブに分注して40ミリリットル（各腱1） </li><li> 15 mlの遠心チューブに分注して10ミリリットル（各腱1） </li><li>オートクレーブでの手術器具、オートクレーブシート、ピンセットとトルクレンチを滅菌</li><li>一晩70％エタノールに浸漬することによってクランプと力のマイクロチップを滅菌</li><li>ウサギの後部足から収穫の腱。ウサギは3回以上の時間前に安楽死されている必要があります。 </li><li> 15 ml遠心チューブに場所の腱は、メディアでいっぱい</li><li>滅菌フィールドを確立するために滅菌オートクレーブのシートをレイアウト</li><li>腱の断面積を測定<ol style="margin-top: 0in"><li>マイクロメータ上に置いてマイクロメータのヒント、適切に整列させる</li><li>両端でグリップの腱</li><li>溝の最薄腱部を適合</li><li>アシスタント場所50グラムの重量を持っている</li><li> 、30秒待ってから、厚さを読んで（CSA =厚さ× 1.3） </li></ol></li><li> 15 ml遠心チューブに戻す腱を配置</li><li>ロードする各腱を繰り返す</li><li>ベースからアクチュエータを削除する</li><li>それぞれの腱のための滅菌ガーゼから5mm部分で3ミリメートル40ミリメートルストリップとで2つの15mmにカット</li><li>しっかりと各ストリップをロールバックし、遠位クランプの溝の間に置く</li><li>クランプ、近クランプの遠位クランプと腱の線維軟骨領域上腱の遠位端に遠心管から腱と場所を削除します。 </li><li>腱の遠位端の上に3X5ガーゼ片を配置し、クランプを固定する</li><li>セキュリティで保護された近位クランプ、腱を確保することはクランプ間とクランプが締まっている時に張力下ではないことを十分なたるみと整列のまま。 1N - mにクランプを締めて</li><li>ベースのメ​​ディアを50ミリリットルの遠心管を配置</li><li>ベースにアクチュエータを配置</li><li>ロードする各腱を繰り返す</li><li>水浴上の拠点を置き、 </li><li>ローディングプロトコル<ol style="margin-top: 0in"><li>前提条件の腱</li><li> 0.5Nの負荷、測定腱の長さを（これはゲージの長さです）を適用</li><li>繰返し荷重を適用する</li></ol></li><li>ベースからアクチュエータを削除する</li><li>クランプからリリース腱</li><li>プロセスの腱</li></ol>

<ol><li>Asundi, K., Kursa, K., Lotz, J. C., Rempel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+system+for+applying+cyclic+loads+to+connective+tissues+under+displacement+or+force+control%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro system for applying cyclic loads to connective tissues under displacement or force control.</a> Ann Biomed Eng. 35, 1188-1195 (2007).</li>
<li>Asundi, K. R., Rempel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+loading+inhibits+expression+of+MMP-3+but+not+MMP-1+in+an+in+vitro+rabbit+flexor+tendon+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cyclic loading inhibits expression of MMP-3 but not MMP-1 in an in vitro rabbit flexor tendon model.</a> Clin Biomech. , In Press Forthcoming.</li>
<li>Asundi, K. R., Rempel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-1%2C+IL-1%CE%B2+and+COX-2+mRNA+Expression+is+Modulated+by+Static+Load+in+Rabbit+Flexor+Tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">MMP-1, IL-1β and COX-2 mRNA Expression is Modulated by Static Load in Rabbit Flexor Tendon.</a> Ann Biomed Eng. , In Press Forthcoming.</li>
</ol>

ビデオでは、組織培養における4つのライブ腱までの同時ローディングのための新しいシステムを紹介。典型的な負荷の継続時間は2〜48時間です。ロード後に、腱が遺伝子発現のために削除され、処理されます。システムは、腱の退行性変化に関連する遺伝子の変化への負荷パターンの影響の調査を行うことが可能。これらの実験は、繰り返し荷重に関連した傷害のメカニズムの洞察を提供することができます。彼らはまた、組織の損傷を引き起こす可能性負荷への洞察を提供する。最終的に、結果は、腱や靭帯に過剰使用の傷害の予防と治療に使用することができます。

システム温水槽50 mlのチューブの腱（ウサギ）をロードするカスタム4リニアアクチュエータ滅菌メディア

腱の生体外で機械的負荷

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

酷使による腱の損傷（例えば、手首の腱炎、epicondyltisは）スポーツ活動と職場で共通です。ほとんどが反復的な、高い力の手の活動に関連付けられています。周期的負荷による細胞性および構造上の損傷のメカニズムはよく知られていない。このビデオの目的は、同時に組織培養の4つの腱を読み込むことができる新しいシステムを提示することである。ビデオは、無菌組織の収穫の方法を説明し、どのように腱が続いてメディアに浸漬し、37℃で維持されているクランプシステム℃までにロードされていますもう一つはリニアアクチュエータで移動させながら一つクランプは固定されています。腱の張力は、モバイルクランプと直列にロードセルで監視されます。アクチュエータは、LabVIEWプログラムで制御されています。 four腱は、繰り返し荷重、繰り返し率、積載率、および継続時間の異なるパターンをロードすることができます。ローディングは、48時間まで数分間継続することができます。ロードの終了時に、腱が削除され、半ば物質は、生化学的解析のために抽出した。このシステムは、遺伝子発現や腱の構造変化のパターンを読み込んでの効果の調査を行うことが可能。最終的に、酷使による損傷のメカニズムは、治療と予防に適用される調査結果と研究することができます。

同時に文化の4つの腱をロードするためのin vitroでの新しいシステムが記載されている。

過用による腱の損傷（例：手関節腱炎、上腕骨外側上顆炎）は、スポーツ活動や職場において一般的に見られます。その多くは……に関連しており、

私の名前はデビッド・レンペルです。カリフォルニア大学バークレー校のバイオエンジニアリング学科の教員を務めています。これからご覧いただく実験では腱の伸展を行い、手首や肘における腱疾患の根底にあるメカニズムを解明することを目的としています。これらの腱疾患は、アスリートや手で反復作業を行う労働者の間で一般的です。当研究室の博士課程学生の一人であるKrish Sundiが、本システムのいくつかの機能、特に腱の断面積の測定について実演します。彼が腱をアクチュエータに装着します。腱に24時間にわたって周期的に負荷をかけ、その後、腱をシステムから取り出す手順を実演します。それでは、こちらが設計・製作した負荷システムです。ご覧の通り、6つのアクチュエータで構成されています。これらは高精度アクチュエータであり、1 µm単位での変位付加が可能です。アクチュエータと直列には、腱に負荷される荷重を記録するためのロードセルが配置されています。ロードセルと直列に接続されているのはこれらのクランプで、腱の生存性を維持するために培地中に浸漬できるよう、十分な長さまで延長されています。このシステム全体をウォーターバスに入れ、培地を37 °Cに維持します。これから、このシステムに腱をロードする方法について説明します。まず最初に行う必要があるのは、適切な応力を負荷できるように、腱の断面積を測定することです。腱が入ったチューブを渡していただけますか？これらの腱はニュージーランドホワイトラビットから採取したものです。採取直後に運ばれてきたため、ラビットの安楽死から2時間以内の新鮮な状態です。腱の断面積を測定する箇所は、腱の最も細い部分に沿った領域です。これは、断面積が最小（最小限）であるため、この箇所に最大の応力が生じるためです。では、ピストンの上に重りを置いてください。ここから、厚さの読み取り値が1.3になるまで30秒間待ちます。ピストンを持ち上げて、腱を培地に戻していただけますか？次に、腱をロードするためのアクチュエータを取り外します。それでは、クランプに腱を取り付けます。ここではアクチュエータの接写を確認できます。アクチュエータ本体、ロードセル、そして外側に伸びるクランプが見えます。これらのパッドは、幅約0.5〜0.75インチ、長さ約1.5インチに切断して使用します。次に、これらのガーゼパッドを培地に入れ、湿らせます。これにより、巻き付ける工程が容易になります。そして、巻き付けたガーゼストリップを、これらのサーペンタインクランプの溝に配置します。これから、腱を培地から取り出します。この末端は、ウサギの指の末端への屈筋腱の挿入部位です。この領域は線維軟骨領域です。線維軟骨領域が近位クランプ内で固定されるように、腱を配置します。次にテンションをクランプし、再度、ネジを1 newton meterまで締め付けます。その後、余剰なテンドンを切断します。これにより、アクチュエータがブレースに固定され、テンドンとクランプ全体が浸漬されます。修正メディアにおいて、後続のアクチュエータにテンドンを装着する場合も、同様の手順を用います。ご覧のように、計6本の腱があるため、6本の個別の腱を用いてこの操作を行うことができます。その後、このシステム全体を持ち上げてウォーターバスに入れ、培地を37°Cに維持します。ここで、腱に対して0.5から5 MPaの範囲で周期的な負荷を印加します。使用するソフトウェアはLabVIEWであり、カスタム作成されたものです。まず最初に行うのは、腱のプレコンディショニングです。0.5 megapascalsから2 megapascalsの間で、20サイクルの周期荷重を加えます。測定した厚さは、提供された4つのマイクロメーターを使用して入力してください。これにより、断面積が自動的に算出されます。その後、プログラムがアクチュエータに指示を出し、腱に 2 MPa の負荷がかかるまで変位を増加させます。ここでは紫色のトレースを追跡しています。腱に2 megapascalの負荷が印加されると、次にプログラムが腱に0.5 megapascalの負荷を印加します。これら2つの負荷が設定されると、プログラムはこれら2つの負荷の間でサイクルを繰り返し、目的の2つの負荷の間で位置を継続的に更新します。この負荷は、周波数 0.5 hertz、負荷速度 10 megapascals per second で行われます。腱のプリコンディショニングが完了した後、0.5 newton の負荷をかけます。0.5 Newton の負荷がかかった状態の腱の長さを、腱の標点距離（ゲージ長）と定義します。プログラムがこの荷重を検出すると、アクチュエータの位置を読み取ります。現在6825と読み取られているこの位置が、腱の標点距離となります。腱の標点距離を記録した後、サイクリック負荷プログラムに戻り、希望する値である5 MPaおよび0.5 MPaを入力し、負荷したい総サイクル数を入力します。そして、再び同じプログラムを実行し、腱に0.5 MPaから5 MPaの間でサイクリック負荷をかけます。なお、この負荷は、周波数0.5 Hz、負荷速度10 MPa/sで実施します。通常24時間の周期的な負荷をかけた後、アクチュエータをシステムから取り外し、腱を切り出して必要に応じて処理します。さて、ウサギから無菌的に採取した腱をご覧いただきました。ここまでに示した工程は準無菌的なプロセスでしたが、これにより腱に対して24時間にわたる周期的な負荷を与えることができました。その後、R-T-P-C-Rを用いて腱の遺伝子発現を解析します。また、構造的変化やその他の組織学的マーカーなど、腱に生じたその他の変化についても解析を行っています。最終的に、本実験の目的は、異なる負荷パターンが、腱障害や腱炎に関連し得る腱損傷の根本的なメカニズムにどのような影響を及ぼすかを明らかにすることです。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、生体力学とmechanobiological研究のためにラット尾腱を調製するのに使用される実験手順を説明します。準備の主要なステップのいくつかの機能は、すすぎとバイオリアクターチャンバーにロードし、抽出、断面積の測定をはじめ、実証されています。...

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私たちは、関節軟骨欠損部に移植前に軟骨バイオ複合に一軸又は二軸の機械的ひずみを適用できる新規な機械的負荷バイオリアクターを設計しました。...

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の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

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この論文では、腱の外植片内の局所的な2D組織ひずみを測定するためのオープンソースのデジタル画像相関アルゴリズムについて説明します。この手法の精度は、複数の手法を使用して検証されており、一般に利用できます。...

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マウス後肢外植片におけるアキレス腱挿入のインピンジメントによって引き起こされる線維軟骨性変化を再現するカスタム実験プラットフォームと組織培養プロトコルを提示し、腱インピンジメントのメカノバイオロジーを探索するのに適したモデルを提供します。...

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

このプロトコルは、酷使誘発性腱炎の 生体内 モデルのために、ラットアキレス腱に定量化可能で制御された疲労損傷を誘発するために使用される試験システムを提示します。この手順は、ラットの足首を、カスタム記述のMATLABスクリプトで受動的な足首背屈を実行する関節アクチュエーターに固定することで構成されます。...

使いすぎ誘発性腱鞘炎の in vivo モデルのための受動的足関節背屈試験システム

ここでは、荷重を支える腱コア組織と、病気や損傷によって活性化された細胞集団を含む外因性区画との間の腱細胞のクロストークを模倣する集合体モデルシステムを紹介します。重要なユースケースとして、外因性内皮細胞の疾患関連活性化を調査するためにシステムをどのように展開できるかを示します。...

腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

学ぶ腱の生体外機械的負荷法。アクチュエーターを用いて4本の腱を同時にサイクリック負荷し、手首や肘の腱障害のメカニズム解明と治療法開発に貢献する研究手法を習得できます。

腱の生体外で機械的負荷

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